环境激素是一类会使人类及生物的内分泌系统发生紊乱的外来物质,它可以影响人类和生物的内分泌系统,导致生殖、发育和行为异常。多氯联苯类化学物质曾被作为优质工业添加剂,大量使用在石油产品、塑料、农药加工等行业。但毒理学研究表明,此类物质具有环境激素的特征,具有一定的致癌性和影响动物体的生殖和发育系统。当今存在的多氯联苯污染物,一部分是由于上世纪遗留下来的,另一部分是由新的污染源产生。由于多氯联苯分子结构的稳定性,使它不易被自然降解和消除,因此,如今在世界的各个地方几乎都能找到它的踪迹,成为一类普遍的环境污染物。多个国家都把它列为优先检测污染物并作为环境监测必检项目,并以严格的排放标准限制它的污染源排放。当前,环境中多氯联苯的检测方法主要有气相色谱、液相色谱和气质联用等色谱分析技术。但色谱技术需要复杂的前处理技术和昂贵的仪器,对操作人员的技术要求也比较高,因此不适于大规模环境样品的现场监测和批量监测。免疫分析技术具有方便快捷、检测成本低、灵敏度高等优点,可以满足简单、快速、灵敏检测环境激素的要求。目前已经有以ELISA为主的多种多氯联苯免疫监测方法,如分子传感器,表面细胞质团共振检测(SPR)等。免疫PCR是1992年由Sano首次提出的,它将体系完善的ELISA分析方法和具有强大信号放大能力的PCR技术结合起来。大量的应用研究表明,该方法与ELISA相比不仅具有很好的一致性而且灵敏度更高,线性范围更广,具有更强的检测能力。免疫PCR在技术和信号检测仪器上的进一步发展,导致了实时定量免疫PCR技术(rt-IPCR)的产生。实时荧光定量免疫PCR是近年来在荧光PCR和免疫PCR基础上建立起来的一种免疫检测新技术。此方法建立以来,已经在癌症、自身免疫缺陷、致病菌和细菌毒性等生物学和医学研究领域得到广泛应用,但是还没有见到有应用在多氯联苯污染物检测方面的报道。该技术和一般免疫PCR与传统的ELISA相比,具有更小的实验室内部误差和更高的灵敏度。因此本论文意在把该技术引入环境学研究领域,建立一种灵敏度更好的检测多氯联苯类环境污染物的新方法,为痕量有机污染物的检测提供一个新思路,对环境中多氯联苯的迁移、转化和降解等环境行为的调查研究提供一种新的检测方法。本文以多氯联苯类环境激素作为检测对象,选择出三种有代表性的多氯联苯单体,根据免疫检测的技术要求,主要通过半抗原衍生物的设计和制备、全抗原和抗体的制备与表征,采用荧光免疫PCR技术,分别建立了三种多氯联苯类环境激素的免疫检测新方法,并应用于实际样品的测定。课题的主要研究内容为：1.多氯联苯单体的合成方法研究：通过联苯胺还原法和改性Gomberg不对称合成法,制备出四种多氯联苯单体,产物通过红外色谱和元素分析进行了表征。通过对三种多氯联苯单体的合成,确立了一种Gomberg不对称合成多氯联苯新方法。2.多氯联苯单体半抗原的合成：通过Friedel-Crafts酰基化反应,在三种多氯联苯分子上引入羧基,合成了PCB12, PCB37, PCB77三种多氯联苯的半抗原衍生物。半抗原的分子结构和化学组成通过了~1H-NMR、IR和元素分析进行表征和确证。3.免疫原的制备：用活化酯法分别将三种半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联,制得PCBs的免疫原；用混合酸酐法将半抗原分别与卵清蛋白(OVA)偶联,制得PCBs的包被原。产物经紫外光谱、蛋白质含量测定等方法给予确证。4.多克隆抗体的制备：通过免疫新西兰大白兔,对血清进行分离和提纯,制备了三种效价高、特异性好的抗多氯联苯类环境激素的新抗体IgG；琼脂双向扩散实验表明PCB12,37,77的抗体效价分别为：1：32,1：32,1：64。5.生物素化探针DNA的制备和纯化：探针DNA是以pUC19质粒为模板扩增得到的一段103个碱基对的生物素化DNA。根据DNA扩增试剂盒的说明,在PCR扩增体系中加入各种反应物,包括两条生物素化了的引物。引物序列分别是：上游引物序列从5’到3’是G TAA AAC GAC GGC CAG T,下游引物的序列从5’到3’是CAG GAA ACA GCT ATG AC。PCR扩增的程序是：940C预变性4 min。然后是30个循环反应,每个循环的程序是94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸20s。30个循环反应后在72℃保持3 min,使延伸完全。使用UNIQ-10 PCR纯化试剂盒,对PCR扩增产物进行纯化后,再用琼脂糖凝胶电泳后染色进行定性,并用紫外分光光度法定量检测分析。6.生物素化抗体和半抗原的制备：通过活化生物素法,使三种抗体与活化生物素(BNHS)进行偶联,产物经过透析纯化后,得到三种PCBs的特异性生物素化抗体；把活化生物素(BNHS)通过混合酸酐法与三种多氯联苯半抗原衍生物进行合成反应,得到了三种生物素化半抗原。产物经紫外光谱、蛋白质含量测定等方法给予确证；7.建立了间接竞争实时定量免疫聚合酶链式反应(间接竞争rt-IPCR)分析方法,用于检测环境中三种PCBs。用制备的包被原包被经过戊二醛处理的PCR小管,接着用PCBs与包被原竞争结合特异性抗体,再利用生物素化二抗与结合在包被原上的特异性抗体结合,然后通过亲和素与制备的生物素化的103bp探针DNA结合,最后通过实时定量PCR仪在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。此方法对PCB12, PCB37, PCB77测定的标准曲线相关系数分别为：0.941,0.961,0.954。对三种多氯联苯的检测限分别达到1.75、1.32和1.50 fg／mL。8.建立了直接竞争实时定量免疫聚合酶链式反应(直接竞争rt-IPCR)分析方法,用于检测环境中三种PCBs。用制备的包被原包被经过戊二醛处理的PCR小管,接着用PCBs与包被原直接竞争结合生物素化特异性抗体,然后通过亲和素与制备的生物素化的DNA探针结合,最后通过实时定量PCR仪在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。此方法对PCB12, PCB37, PCB77测定的标准曲线相关系数分别为：0.987,0.988,0.985。对三种多氯联苯的检测限分别达到1.53、1.42和1.25 fg／mL。9.建立了抗体包被实时定量免疫聚合酶链式反应(抗体包被rt-IPCR)分析方法,用于检测环境中三种PCBs。用制备的特异性抗体包被经过戊二醛处理的PCR小管,接着用PCBs与生物素化半抗原竞争结合特异性抗体,然后通过亲和素与制备的生物素化的DNA探针结合,最后通过实时定量PCR仪在优化的扩增程序下扩增DNA并实时检测。此方法对PCB12, PCB37, PCB77测定的标准曲线相关系数分别为：0.966,0.971,0.985。对三种多氯联苯的检测限分别达到1.75、1.45和1.33fg/mL。比较这三种方法可知,间接竞争rt-IPCR的检测灵敏度和工作曲线的相关性略低于其它两种方法。直接竞争rt-IPCR和抗体包被rt-IPCR均有较好的工作曲线相关性。通过对检测过程各步的优化发现,当采用0.8%的戊二醛溶液处理聚丙烯PCR管后,可以提高对抗原抗体的吸附能力,同时各种包被介质和包被时间、最佳抗原抗体结合浓度,包被液和封闭液、以及亲和素和生物素化DNA探针的浓度被优化,这些优化措施提高了检测的准确性。方法的特异性、回收率也被加以研究,并应用于实际土壤和污泥等环境样品的检测。结果表明,各种方法的交叉反应率小于15%,回收率在85～110%之间,样品的检测结果与GC／MS法的测定结果相比,具有良好的一致性。本论文建立的三种检测多氯联苯rt-IPCR方法均未见文献报道。