巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前世界上应用最广泛的外源蛋白表达系统之一,该系统最常用的启动子为AOX1启动子,其高效表达离不开甲醇的诱导。但甲醇耗氧多、产热大、有毒并且易燃,在工业生产中需进行防爆设计,导致生产成本增大。为了避免使用甲醇带来的危害,本实验室对AOX1启动子的调控机理进行了研究,并通过基因工程的方法,成功地开发出新型无甲醇毕赤酵母表达系统。尽管如此,毕赤酵母的AOX1启动子的调控机理仍不清楚,之前采用的方法为参考其他酵母研究成果或者大规模的突变筛选,但这样的研究方法费时费力,且具有一定的局限性。随着mRNA测序技术和代谢物高通量分析技术的发展,转录组学和代谢组学成为研究生物体转录和代谢调控网络的重要手段,为菌种改进、重构基因组及表达调控系统提供了更全面的理论基础。虽然,毕赤酵母中已经有DNA芯片、mRNA测序、代谢组和代谢流等系统生物学的研究,但对AOX1启动子的调控网络的研究还未见报道。本研究结合RNA-seq技术和LC/MS-GC/MS平台,对新型无甲醇毕赤酵母表达系统的转录和代谢调控网络进行了研究。通过比较野生型和重组型毕赤酵母的转录组和代谢组,鉴定出了一些与AOX1启动子调控相关的基因,更好地了解了新型无甲醇毕赤酵母系统的转录和代谢调控网络。从本实验室已经鉴定的两个毕赤酵母碳源阻遏因子Mig1、Mig2出发,本研究利用RNA-seq测序技术,绘制并比较了野生型菌株和碳源脱阻遏菌株Amig1Δmig2的全基因组水平的转录组图谱。RNA-seq结果显示,与野生型菌株相比,菌株△mig1Δmig2中有357个基因表达量显著上调,占到总5,276个表达基因的7%,其中基因AOX1和AOX2的表达量上调最高,分别为32倍和33倍,与甲醇代谢和过氧化物酶体生物合成途径相关的基因也有显著上调;表达量显著下调的基因有1,197个,占到总表达基因的23%,这些基因主要涉及到线粒体相关的代谢途径。通过对转录调控因子表达量的差异分析,发现菌株△mig1Δmig2中转录调控因子Mit1的表达量有显著提高。利用qRT-PCR对不同时间点的基因AOX1和MIT1的表达量的测定,发现这两个基因的表达模式相关性很高,推测Mit1可能是AOX1启动子的一个调控因子。结合RNA-seq测序技术和LC/MS-GC/MS平台,对野生型菌株和新型无甲醇毕赤酵母表达系统△mig1△mig2△nrg1-Mit1进行了转录组和代谢组的研究。通过对高通量转录组数据挖掘,检测到了 9种类型的可变剪切事件并发现了 62个新转录本。工程菌株△mig1Δmig2△nrg1-Mit1在葡萄糖和甘油中,与甲醇利用途径相关的酶以及跟过氧化物酶体生物合成相关的基因的表达量都有增强。通过对转录组数据的聚类分析,发现了一些与AOX1基因表达相关的基因,其中基因PASchr2-10748的缺失会导致毕赤酵母在甲醇中无法生长,推测该基因与AOX1启动子的调控有密切的关系。代谢组数据显示,在葡萄糖、甘油或甲醇的培养条件下,工程菌株的氨基酸和能量代谢等途径中代谢物的含量相对于野生型菌株都有显著增加。多基因的改造并没有减弱毕赤酵母的代谢途径,反而起到增强的作用,利于细胞的生长和外源蛋白的表达。本研究首次利用系统生物学的方法,对毕赤酵母AOX1启动子的调控机理进行了研究,并提供了大量的相关信息,这将有助AOX1启动子调控机理进一步的研究,为新型无甲醇毕赤酵母表达系统的改进提供了重要的理论指导。