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真菌病害严重威胁着人类健康和农业生产安全。在农业上，真菌病害占农作物病害的70％以上，是导致作物减产和品质下降的最主要原因。而对于人类健康而言，真菌感染日趋严重而备受关注，尤其随着由艾滋、癌症以及器官移植而导致免疫系统受损的病人日益增多，机会致病真菌如烟曲霉、念珠菌及隐球菌的入侵及其较高的致死率已成为一个严重的问题。唑类抗真菌药物具有低毒高效的特点，广泛应用于医疗和农业领域。然而，其广泛应用亦导致真菌对一种甚至多种抗真菌药物产生耐药性。总的说来，近年发现的药物耐受性真菌菌株正逐年增加，造成了真菌感染几率的增加;同时，真菌耐药性的存在也大大降低了抗真菌药物疗效，增加了治疗成本。因此，深入研究真菌耐药性的机制将对合理用药和新靶点抗真菌药物的开发提供重要的理论依据。 真菌通过改变唑类药物作用靶标的氨基酸序列或提高药靶、药泵的表达水平是提高自身对唑类药物适应和耐受的主要方式。有关唑类药物耐受调控方面的研究，在酿酒酵母、白色念珠菌等单细胞真菌中相对多，而在丝状真菌中较少。实验室前期工作以模式丝状真菌粗糙脉孢菌为材料，对耐药机制进行了较系统的研究，鉴定了多个唑类药物耐受相关的基因，包括粗糙脉孢菌中主要的唑类药物外排转运蛋白基因cdr-4、唑类药物作用靶标编码基因erg-11及其下游基因erg-5、转录因子ccg-8、ads-4、ads-5和转录抑制子csp-1等，这也说明丝状真菌中存在与酵母菌完全不同的、调控唑类药物胁迫响应和耐受的机制。本研究以粗糙脉孢菌为材料，通过过表达CCG-8进一步解析了转录因子CCG-8对唑类药物的耐受调控机制。同时，分析了与唑类药物作用靶标ERG-11及对真菌耐药具有重要贡献的ERG-5同属于细胞色素P450家族的其它17个细胞色素P450家族蛋白在真菌对唑类药物耐受性中的作用。 在唑类药物胁迫下，真菌在全基因组的范围上作出转录响应，转录因子通过调控耐药相关基因的表达而在这一过程中发挥关键作用。我们实验室前期发现了粗糙脉孢菌中对唑类药物耐受具有重要调控作用的转录因子CCG-8，并通过转录表达谱解析了CCG-8调控的下游基因及这些基因在真菌耐药性中的贡献，但CCG-8的调控机制仍需进一步解析。为了进一步研究ccg-8对唑类药物响应的调控，我们过表达了ccg-8基因。在过表达菌株中，与野生型相比，ccg-8的表达水平提高了231倍。药物敏感性实验显示，ccg-8过表达比ccg-8敲除突变和野生型表现出更耐受的特性。这进一步证实了CCG-8正向调控真菌对唑类药物的耐受性。根据已有的研究，我们选择了18个可能受ccg-8调控的基因进行进一步的分析。粗糙脉孢菌野生型、ccg-8敲除突变体和过表达菌株在加和不加酮康唑条件下液体培养24小时后，通过qRT-PCR分析过表达ccg-8后这些基因的转录变化。结果发现，在酮康唑胁迫下，过表达ccg-8后，erg-11、代谢调控基因如精氨酸酶基因、水解酶基因、已糖转运蛋白基因和四个新的酮康唑敏感基因(kts-2、kts-4、kts-6和kts-8)等相对于野生型菌株均表现为上调。为了了解CCG-8对麦角甾醇生物合成的影响，我们通过HPLC-MS研究了酮康唑胁迫下甾醇衍生物的生物合成，发现ccg-8敲除导致麦角甾醇合成量的降低以及毒性甾醇14α-甲基-3，6-二醇在胞内的升高。 唑类药物作为应用最广泛的抗真菌药物，其作用靶标ERG-11及其下游蛋白ERG-5在唑类药物耐受性中发挥着重要作用。这两个蛋白均属于细胞色素P450家族蛋白，而在粗糙脉孢菌中除了上述两个蛋白外还存在着多个P450家族蛋白，他们对真菌耐药性的贡献并不清楚。基于此，本研究以模式丝状真菌粗糙脉孢菌为材料，分析细胞色素P450家族蛋白在真菌对唑类药物耐受性的作用。通过对包括ERG-5在内的18个P450家族蛋白的敲除突变体对唑类药物的敏感性分析，我们发现除已报道的ERG-5之外，其他P450家族蛋白编码基因敲除突变体与野生型相比，对唑类药物敏感性的敏感性相似。进一步，我们又测定了这些敲除突变体对苯甲酸的敏感性，从中筛选到了一个对苯甲酸的敏感的突变体，其对应基因(NCU08128)编码一个苯酸-4-单氧化酶。我们进一步分析了该基因对苯甲酸的敏感的可能机制。 总结起来，我们的研究以模式丝状真菌粗糙脉孢菌为材料，明确了ERG-11与ERG-5以外的其它细胞色素P450家族蛋白在真菌对唑类药物耐受性的作用。同时，通过过表达CCG-8分析进一步解析了转录因子CCG-8对唑类药物的耐受调控机制。以上研究丰富了丝状真菌的耐药机制并为新型抗真菌药物的研发提供了新的靶标。