目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤,起源于神经嵴,常原发于肾上腺,其死亡率约占儿童肿瘤死亡率的15%。根据已明确的预后因素,包括确诊年龄、国际神经母细胞瘤分期系统(INSS)、组织病理学、DNA指数和MYCN基因扩增情况,将患者分为低危、中危和高危组。高危组患者预后较差且易复发,其中肿瘤耐药是治疗过程中存在的最大障碍。因此,寻求新的药物以提高NB患者治疗效果并改善预后的愿望尤为迫切。Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,在多种肿瘤中发挥重要作用。在NB肿瘤组织中可以检测到Akt活性增强,Akt活性增强的NB患者往往预后较差,表明NB患者的预后与Akt的活化有着密切联系。MK-2206是Akt的特异性抑制剂,我们前期研究发现MK-2206作为单一药物不仅具有抑制NB细胞体内体外生长的作用,而且能够提高NB细胞对化疗药物的敏感性。有研究人员发现,MK-2206与mTOR抑制剂RAD001联合治疗肝癌和胆管癌细胞具有协同作用。我们前期研究发现,MK-2206和mTOR抑制剂rapamycin联合应用时在某些NB细胞中产生明显的协同作用,这些NB细胞具有MYCN扩增的共同特点,这种协同作用的具体机制目前尚无报道。MYCN原癌基因是一种转录因子,约20-30%的NB患儿具有MYCN扩增,预后较差,而约40%的高危组患儿具有MYCN扩增的特点,MYCN的扩增与NB患者的耐药及预后密切相关。MYCN基因扩增可作为判断NB预后不良的独立因素。目前,MYCN在MK-2206和rapamycin联合治疗NB产生协同作用中的重要作用尚无文献报道,这一研究能够为预后较差及耐药的MYCN扩增的NB患者提供新的治疗方案。本研究将进一步探索MK-2206和rapamycin联合应用诱导NB细胞死亡的机制及MYCN在MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡过程中的重要作用,这对MYCN扩增的NB患者的临床治疗具有重要意义。研究方法:本研究采用4种NB细胞系,MYCN扩增的NGP细胞和SK-N-BE2(BE2)细胞及 MYCN 非扩增的 SK-N-AS(AS)细胞和 SH-SY5Y(SY5Y)细胞。1、应用CCK-8,检测药物处理后的细胞活力。2、应用YOYO-1染色,观察死细胞数量的变化。3、应用IncuCyte Zoom动态观察并统计细胞融合率变化,间接说明细胞增殖或存活的变化。4、应用基因芯片筛选MK-2206和rapamycin联合处理BE2细胞后的差异表达基因。5、应用透射电子显微镜观察细胞自噬和程序性坏死的超微结构。6、应用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白(ATG5、ATG7、Beclin-1和LC3)、程序性坏死相关蛋白(RIPK1和RIPK3)和MYCN的表达变化情况。7、建立NGP细胞移植瘤裸鼠模型。将小鼠分为四组:空白对照组、rapamycin组、MK-2206组和MK-2206+rapamycin组。分别按照如下方式给药:rapamycin每天腹腔注射5 mg/kg,MK-2206一周三次灌胃200 mg/kg。给药10天后取出肿瘤组织,进行后续试验。8、应用HE染色观察小鼠肿瘤组织中的细胞形态变化。9、应用免疫组织化学染色检测程序性坏死相关蛋白(RIPK1和RIPK3)在小鼠肿瘤组织中的表达变化情况。10、应用细胞转染的方法,分别在NGP和BE2细胞中转染siRNA沉默MYCN基因,并在AS和SY5Y细胞中转染质粒过表达MYCN基因,转染后的细胞用于后续实验。11、应用Seahorse能量代谢分析仪检测ECAR值和OCR值,说明NB细胞糖酵解和线粒体氧化磷酸化的水平变化。结果:1、MK-2206和rapamycin联合应用治疗NB细胞具有协同作用且不依赖于caspase活性:在NGP和BE2细胞中,MK-2206+rapamycin组细胞存活率较rapamycin组和MK-2206组细胞存活率明显降低(P<0.01),死细胞数量明显增多。另外,caspase抑制剂z-VAD-fmk不能阻断MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡。2、基因芯片结果中筛选出自噬和程序性坏死相关的差异基因,如:ATG3、ATG5、ATG7、ATG9、RIPK3、TNFR 等。3、细胞自噬介导了 MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡:NGP、BE2细胞经过自噬抑制剂3-MA预处理后,3-MA+MK-2206+rapamycin组的细胞存活率比MK-2206+rapamycin组的细胞存活率分别提高了 2.1倍和2.3倍,差异均具有统计学意义(P<0.01)。应用透射电镜观察到联合用药组细胞自噬小体数量增多。Western Blot结果显示联合用药组自噬相关蛋白分子ATG5、ATG7、Beclin-1和LC3 Ⅱ表达水平均升高。4、细胞程序性坏死介导了 MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡:NGP、BE2细胞经过程序性坏死抑制剂Nec-1预处理后,Nec-1+MK-2206+rapamycin组的细胞存活率比MK-2206+rapamycin组的细胞存活率分别提高了 2.4倍和2.2倍,差异均具有统计学意义(P<0.01)。应用透射电镜观察到联合用药组细胞出细胞膜破裂、不完整等细胞程序性坏死的典型特征。Western Blot结果显示联合用药组程序性坏死相关蛋白分子RIPK1表达水平降低、RIPK3表达水平升高。5、MK-2206和rapamycin联合应用诱导裸鼠NB肿瘤组织细胞死亡且细胞自噬和程序性坏死相关蛋白发生相应变化:裸鼠NGP肿瘤细胞的HE染色结果显示联合用药组细胞出现细胞浆嗜酸性深染、细胞核固缩的形态特点。免疫组织化学染色结果显示程序性坏死相关分子RIPK1表达水平降低、RIPK3表达水平升高。Western Blot结果显示NGP肿瘤组织中自噬相关蛋白分子ATG5、ATG7、Beclin-1、LC3 Ⅱ表达水平升高,程序性坏死相关分子RIPK1表达水平降低、RIPK3表达水平升高。6、沉默MYCN基因可逆转MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡:在MYCN扩增的NGP和BE2细胞中转染siRNA沉默MYCN,联合用药后CCK-8检测结果显示:细胞存活率在NGP细胞中分别提高了 35.2%(si MYCN#1)和 40.7%(si MYCN#2);在 BE2 细胞中分别提高了 44.4%(si MYCN#1)和 40.7%(si MYCN#2),差异具有统计学意义(P<0.01)。Western Blot 结果显示在NGP、BE2细胞中沉默MYCN后,MK-2206和rapamycin联合应用诱导升高的ATG5、ATG7、Beclin-1、LC3Ⅱ、RIPK3蛋白表达水平降低,降低的RIPK1蛋白表达水平升高。7、在MYCN非扩增的NB细胞中过表达MYCN可增加NB细胞对MK-2206 和 rapamycin 联合应用 的敏感性:在 MYCN 非扩增的 AS 和 SY5Y 细胞中转染MYCN过表达质粒后,给予MK-2206和rapamycin联合治疗,CCK-8检测结果显示:在AS细胞中,联合用药组细胞存活率为76.34%,过表达MYCN后联合用药组细胞存活率降低为46.21%;在SY5Y细胞中,联合用药组细胞存活率为74.93%,过表达MYCN后联合用药组细胞存活率降低为50.97%,差异具有统计学意义(P<0.05)。应用IncuCyte Zoom活细胞动态成像系统观察到AS、SY5Y细胞过表达MYCN后的联合用药组细胞融合率较单独用药组明显降低。Western Blot结果显示AS和SY5Y细胞过表达MYCN后的联合用药组ATG5、LC3 Ⅱ、RIPK3蛋白表达水平升高,RIPK1蛋白表达水平降低。8、MK-2206和rapamycin联合处理NGP细胞后糖酵解功能受损:MK-2206和rapamycin联合应用后NGP细胞ECAR值降低,糖酵解功能受损。9、MYCN表达水平与糖酵解水平呈正相关、与线粒体氧化磷酸化水平呈负相关:在NGP细胞中沉默MYCN后,ECAR值降低、OCR值升高,说明糖酵解水平降低、线粒体氧化磷酸化水平升高;在AS细胞中过表达MYCN后,ECAR值升高、OCR值降低,说明糖酵解水平升高、线粒体氧化磷酸化水平降低。结论:1、MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡不依赖于caspase 活性。2、自噬和程序性坏死介导了 MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡。3、MK-2206和rapamycin联合应用诱导的NB细胞死亡依赖于MYCN的表达。4、MYCN表达水平与糖酵解水平呈正相关、与线粒体氧化磷酸化水平呈负相关。