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CAR-T疗法是近20年来最具前景的肿瘤免疫疗法,但是药物成本过高、普通患者无法承担高额的治疗费用,如何提高CAR-T细胞抗肿瘤的疗效已越来越成为科学家关注的焦点。胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)参与调节胆固醇代谢,进而影响T细胞的抗肿瘤能力。本研究以αCD19-CAR-T为基础,联合RNA干扰技术探讨沉默ACAT1后是否会增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果,以制备新型CAR-T,通过减少使用量,以期降低治疗成本。根据GenBank中的ACAT1基因序列,设计合成三条特异性靶向ACAT1的shRNA,插入到p LL3.7-U6-EF1α-EGFP慢病毒载体中,与辅助质粒共转染293T细胞,制备能够沉默ACAT1表达的慢病毒;通过感染Jurkat细胞,从m RNA和蛋白水平筛选出沉默ACAT1表达效果最佳的shRNA;构建pLL3.7-ACAT1-shRNA-αCD19-CAR慢病毒载体并包装成慢病毒后感染T细胞,制备ACAT1-shRNA-αCD19-CAR-Jurkat、ACAT1-shRNA-αCD19-CAR-T细胞,从抗肿瘤能力、增殖能力、细胞活化等方面探讨沉默ACAT1对CAR-T细胞免疫学功能的影响。测序结果显示合成的三条干扰序列和一条阴性对照序列成功插入到p LL3.7-U6-EF1α-EGFP载体上;干扰效果检测证明ACAT1-shRNA-1沉默效果最佳,可以显著沉默细胞内ACAT1的表达,并且沉默效果具有持续性;成功构建p LL3.7-ACAT1-shRNA-αCD19-CAR载体,制备的浓缩病毒滴度大于2×10~8TU/m L;慢病毒感染T细胞系,流式细胞术检测慢病毒感染效率在80%以上,与靶细胞共培养,结果显示沉默ACAT1后αCD19-CAR-Jurkat细胞杀伤肿瘤能力增强、活化水平提升、IFN-γ和Gzm B表达上调、脱颗粒现象增强;慢病毒感染原代T淋巴细胞阳性率在25~50%,尽管如此,ACAT1-shRNA也可以抑制αCD19-CAR-T细胞中ACAT1的表达,沉默效果在40%左右,可有效增强αCD19-CAR-T细胞的免疫学功能。本研究实验结果证明下调ACAT1能有效增强CAR19-T细胞抗肿瘤功能,为新型CAR-T细胞的研究提供了实验依据。