多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种克隆性浆细胞异常增生的恶性肿瘤,目前即便给与传统药物化疗、免疫调节剂(沙利度胺或来那度胺)、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)及自体干细胞移植等综合治疗,大多数患者最终仍不可避免出现疾病复发或者进展。因此,寻找更加高效的药物或药物组合一直是MM治疗领域的研究热点。组蛋白表观遗传学是近年来遗传学的研究热点。组蛋白的乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化修饰等通过改变组蛋白和DNA之间的亲和力从而导致相关基因转录改变,其中组蛋白乙酰化作用尤其引人关注。越来越多研究表明,肿瘤的发生发展与组蛋白乙酰化状态密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)作为一种特异性靶向组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抗癌新药越来越引起人们的关注。FDA已经批准伏立诺他(vorinostat)、贝利司他(belinostat)和罗咪酯肽(romidepsin)用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤(PTCL),批准帕比司他(panobinostat)用于治疗复发或难治性MM。西达本胺是我国首个自主研发的亚型选择性HDACi,用于治疗复发或难治性PTCL取得了不错的治疗效果,CFDA已经批准用于治疗复发或难治的PTCL。近年来,研究者评估了西达本胺在不同种类肿瘤细胞系中的抗肿瘤活性,大量研究证实西达本胺对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌及淋巴瘤等多种肿瘤均有抗肿瘤作用。研究发现HDAC在多发性骨髓瘤中过表达,HDAC过表达的骨髓瘤患者预后较差,并且HDACi(伏立诺他和帕比司他等)单药或联合硼替佐米具有良好的抗骨髓瘤效应。因此我们推测西达本胺也可能是治疗多发性骨髓瘤的有效药物,并且可能与硼替佐米具有协同抗骨髓瘤作用。为此,我们选择多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和U266细胞为研究对象,观察西达本胺单药或联合硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用并探索其可能的机理。本实验分三部分进行:第一部分:西达本胺抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究。第二部分:西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究。第三部分:基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤作用机制的研究。第一部分西达本胺抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究目的:明确西达本胺对人骨髓瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用并探讨其相关机制。方法:1.CCK-8法检测西达本胺对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖抑制作用;2.流式细胞仪PI染色方法检测西达本胺作用后细胞周期变化;3.Wright-Giemsa染色观察西达本胺作用后细胞形态学改变;流式细胞仪AnnexinV/PI双染方法检测西达本胺作用后细胞凋亡比例变化;4.Western Blot方法检测西达本胺作用后组蛋白去乙酰化酶、细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:1.0.5-8μmol/l西达本胺能够抑制骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖活性,西达本胺对RPMI8226细胞株在24h、48h及72h的IC50值分别为9.09±0.58μmol/l、1.19±0.36μmol/l和0.77±0.21μmol/l(p<0.001),对U266 细胞株的 24h、48h 及 72h 的 IC50 值分别为 16.16±2.51μmol/l、8.06±1.02μmol/l 和2.86±0.58μmol/l(p<0.001),呈现明显浓度依赖性及时间依赖性。2.2μmol/l西达本胺处理RPMI8226细胞48h后,G1期细胞比例由28.12±1.50%升至42.42±4.80%(p<0.0.5),8μmol/l西达本胺处理U266细胞48h后,G1期细胞比例由 42.31±1.43%升至 71.25±4.65%(p<0.05)。3.2μmol/1西达本胺处理RPMI8226细胞48h后,总凋亡细胞比例从7.12±2.50%升至31.51±4.52%(p<0.05),并且光镜下可见凋亡小体、核碎裂等凋亡特征性形态学改变;8μmol/l西达本胺处理U266细胞48h后,细胞总凋亡率由6.82±2.41%升至18.21±3.51%(p<0.05),同样在光镜下可见凋亡小体、核碎裂等凋亡特征性形态学改变。4.西达本胺能够明显下调HDAC1、HDAC2及HDAC3表达,上调H3及H4乙酰化水平,能够激活 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PAPR。5.西达本胺使p53磷酸化水平升高,c-myc及cyclinD1表达明显下调,p21表达明显上调;使Bax表达明显上调,Bcl-2及mcl-1表达明显下调,导致Bax/Bcl-2比率升高。结论:西达本胺对人骨髓瘤细胞株具有增殖抑制作用。西达本胺通过增加H3及H4乙酰化水平,诱导caspase途径依赖的细胞凋亡及p53依赖的G0/G1细胞周期阻滞。西达本胺有望成为有效的抗骨髓瘤候选药物。第二部分西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制研究目的:明确西达本胺增敏硼替佐米抗骨髓瘤细胞增殖作用及其机制。方法:1.CCK-8法检测硼替佐米联合西达本胺对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266细胞的增殖抑制作用;2.流式细胞仪PI染色方法检测药物联合作用后细胞周期变化;3.流式细胞仪AnnexinV/PI双染方法检测药物联合作用后细胞凋亡比例变化;4.Western Blot检测药物联合作用后组蛋白去乙酰化酶、细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:1.硼替佐米联合西达本胺作用48h可以显著抑制RPMI8226和U266细胞的增殖。0.5μmol/l西达本胺单药处理RPMI8226细胞48h后的生长抑制率为18.02±3.74%。硼替佐米(1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml)联合 0.5μmol/l 西达本胺处理RPMI8226细胞48h后的抑制率分别从(31.35±5.94%,85.71±4.33%,96.88±2.77%)提高到(65.40±3.35%,96.70±2.65%,98.35±1.14%)(p<0.05),且两药联合指数<1。2μmol/l西达本胺单药对U266细胞作用48h的生长抑制率为21.91±2.45%。硼替佐米(1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml)联合 2μmol/l 西达本胺作用 U266 细胞 48h 后的抑制率分别从(3.87±1.79%,28.48±5.63%,55.26±4.97%)提高到(35.51±3.14%,69.34±8.61%,89.21±1.35%)(p<0.05),且两药联合指数<1。2.在RPMI8226细胞中,1.25ng/ml硼替佐米处理48h后G2期细胞比例由12.83±1.10%升至 42.09±19.81%(p<0.05),联合 0.5μmol/l 西达本胺作用 48h 后G2期细胞比例为51.90±14.12%,与硼替佐米单药组无统计学差异(p>0.05)。在U266细胞中,2.5ng/ml硼替佐米处理48h后G2期细胞比例由19.70±5.49%升至46.86±11.65%(p<0.05),联合2μmol/l西达本胺作用48h后G2期细胞比例为42.98±5.57%,与硼替佐米单药组无统计学差异(p>0.05)。3.硼替佐米联合西达本胺诱导细胞凋亡比例明显增加。西达本胺单药与硼替佐米单药作用RPMI8226细胞48h后细胞总凋亡率分别为18.34±2.23%及36.23±2.45%,而两药联合后的细胞总凋亡率为52.14±5.23%,明显高于单药组(p<0.05)。西达本胺单药与硼替佐米单药作用U266细胞48h后细胞总凋亡率分别为8.94±3.16%,23.28±3.57%,两药联合后细胞总凋亡率35.42±4.54%,明显高于单药组(p<0.05)。4.硼替佐米联合西达本胺能够下调HDAC1、HDAC2、HDAC3表达并维持H3 及 H4 高乙酰化水平,激活 caspase-3、caspase-8、caspase-9 及 PAPR。5.硼替佐米联合西达本胺后使Bax表达明显上调,Bcl-2及mcl-1表达明显下调,使Bax/Bcl-2比率升高;cyclinB表达下调,p21表达上调。结论:西达本胺增强硼替佐米对人骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266增殖抑制作用和诱导凋亡作用。本研究为西达本胺联合硼替佐米应用于临床抗骨髓瘤治疗提供了实验依据。第三部分基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤作用机制的研究目的:基于全转录组测序技术分析西达本胺抗骨髓瘤的作用机制。方法:以加入等体积细胞培养基为对照组,用lμmol/l西达本胺处理RPMI8226细胞株24h后,使用TRIzol法提取RNA,标本送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全转录组测序(RNA-Seq)。使用Illumina测序检测差异基因。差异基因集的GO功能富集分析、KEGG通路富集分析及Reactome通路富集分析均采用clusterProfiler软件进行,蛋白质相互作用采用cytoscape软件分析。选取10个差异表达明显的基因用qRT-PCR方法验证。结果:1、以padj<0.05为准,全转录组测序差异基因分析提示与对照组相比,1μmol/l西达本胺作用RPMI8226细胞株24h后表达差异显著的基因共463个,其中上调基因457个,下调基因6个。选取的10个差异基因的qRT-PCR结果与转录组测序结果基本一致。2、差异基因GO分析提示差异基因主要富集在化学信号传递、神经突触形成、细胞形态、细胞生长信号调控、细胞间相互作用等过程;差异基因KEGG分析提示差异基因主要富集在轴突导向、PI3K/AKT信号途径、细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子及癌症相关蛋白聚糖等8个途径;差异基因Reactome分析提示差异基因主要富集在细胞外基质代谢、神经轴突导向信号、神经系统疾病、基质金属蛋白酶的活化等。3、与PI3K/AKT信号通路相关的差异表达基因有23个,均为上调基因。与轴突导向相关的差异表达基因有16个,均为上调基因。4、通过蛋白质相互作用分析,得到7个重要的差异表达基因,分别是SRC、MMP9、MMP2、NOTCH3、MYH14、GNAO1 及 RHOC。结论:西达本胺影响多发性骨髓瘤细胞多条信号通路和多种生物学功能,其中需要特别关注PI3K/AKT信号通路及轴突导向通路。总结1、西达本胺对人骨髓瘤细胞株具有增殖抑制作用和诱导凋亡作用。2、西达本胺通过增加H3及H4乙酰化水平,诱导caspase途径依赖的细胞凋亡和G0/G1细胞周期阻滞。3、西达本胺增强硼替佐米对人骨髓瘤细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用。4、西达本胺增强硼替佐米对骨髓瘤细胞诱导caspase途径依赖的细胞凋亡。5、西达本胺影响多发性骨髓瘤细胞多条信号通路和多种生物学功能。其中需要特别关注PI3K/AKT信号通路及轴突导向通路。6、西达本胺有望成为有效的抗骨髓瘤候选药物。