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肝细胞癌(HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤,约占原发性肝癌的85%,是全球与癌症死亡相关的第六大常见肿瘤。据统计,每年新增病例约84.1万人,其中我国每年的发病率约占世界总数的一半。肝细胞癌的发生是多种因素共同作用的结果。因此,探讨肝细胞癌发生发展过程中复杂的生物学机制有重大意义,以期能为肝细胞癌的诊治提供新的理论依据和实验数据。TIGIT是近年来新发现的一种负性共刺激分子,在参与诱导T细胞免疫耐受和肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,TIGIT主要表达于活化的免疫细胞表面,鲜有报道其表达于肿瘤细胞表面;CD155(PVR)是免疫球蛋白超家族成员之一,是与TIGIT结合亲和力最好的配体之一,主要表达于抗原提呈细胞或肿瘤细胞表面,与TIGIT相互作用后能够抑制宿主细胞的免疫应答,导致肿瘤微环境中的免疫细胞发生“衰竭”。本课题旨在探讨TIGIT-CD155通路对肝癌细胞和免疫细胞的生物学功能的影响,同时探讨了肝细胞癌患者外周血TIGIT+T细胞的表型及功能变化。第一部分TIGIT-CD155通路调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的研究目的明确TIGIT、CD155调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的机制。方法设计、构建靶向TIGIT、CD155的mi R-206、TIGIT si RNA和CD155si RNA,通过体内、外试验探究TIGIT、CD155调控肝癌细胞、免疫细胞生物学功能的机制。1.利用本研究室已构建成功的靶向TIGIT的mi R-206慢病毒载体感染肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞,利用CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,划痕实验检测肝癌细胞体外迁移能力,Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移、侵袭能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞中TIGIT及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达水平,采用裸鼠皮下成瘤实验观察肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的情况,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达情况来验证靶向TIGIT的mi R-206能否有效抑制肿瘤的发生和发展;2.利用mi R-206慢病毒载体感染构建成功的TIGIT过表达Jurkat T(OE)细胞,CCK-8实验检测Jurkat T(OE)细胞增殖能力的改变,Western blot检测Jurkat T(OE)细胞TIGIT及与凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达情况;3.利用Western blot检测肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞中TIGIT的表达情况,设计TIGIT的si RNA,通过转染试剂将其转染至肝癌细胞,利用CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,划痕实验检测肝癌细胞体外迁移能力,Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移、侵袭能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞中TIGIT及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2的表达水平,采用裸鼠皮下成瘤实验,观察TIGIT si RNA对肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的情况,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达情况,来验证靶向TIGIT的si RNA能否有效抑制肿瘤的发生和发展;4.利用Western blot检测肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721和Bel-7402细胞中CD155的表达情况,设计CD155的si RNA,通过转染试剂将其转染至肝癌细胞,CCK-8实验检测肝癌细胞体外增殖能力,流式细胞术检测肝癌细胞体外凋亡能力,Western blot检测肝癌细胞CD155及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-2、FAK和SRC、凋亡相关蛋白BAX和Bcl-2表达情况,采用裸鼠皮下成瘤实验,观察CD155 si RNA对肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下成瘤的影响,免疫组化和Western blot检测裸鼠瘤体组织中CD155的表达情况,来验证靶向CD155的si RNA能否有效抑制肿瘤的发生和发展。结果1.mi R-206慢病毒载体感染肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞后,CCK-8实验结果显示:与NC组相比,mi R-206能抑制肝癌细胞体外的增殖能力,有统计学差异(P<0.05),划痕实验、Transwell实验结果显示:与NC组相比,mi R-206能抑制肝癌细胞体外的迁移和侵袭能力,有统计学差异(P<0.05),流式细胞术结果显示:与NC组相比,mi R-206能促进肝癌细胞的凋亡,有统计学差异(P<0.05),Western blot结果显示:与NC组相比,mi R-206组肝癌细胞中TIGIT及肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9的表达降低,促凋亡蛋白BAX的表达增加而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,裸鼠皮下成瘤实验显示:肝癌细胞SMMC-7721在感染mi R-206慢病毒后,裸鼠皮下肿瘤的生长明显受到抑制,与NC组相比,肿瘤的体积减少、重量减轻,有统计学差异(P<0.05),免疫组化和Western blot结果显示:经mi R-206慢病毒感染后裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达水平降低;2.mi R-206慢病毒载体感染TIGIT过表达的Jurkat T细胞(Jurkat(OE))后,CCK-8实验结果显示:与NC组相比,Jurkat(OE)细胞增殖能力增加,有统计学差异(P<0.05),Western blot实验结果显示:与NC组相比,Jurkat(OE)细胞TIGIT和促凋亡蛋白BAX表达水平下降,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加;3.Western blot结果显示:肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215、SMMC-7721和Bel-7402细胞中TIGIT有表达,其中Hep G2.215、SMMC-7721细胞TIGIT的表达较高,通过将TIGIT si RNA转染至肝癌细胞Hep G2、Hep G2.215细胞后,CCK-8实验结果显示:与对照组相比,TIGIT si RNA能抑制肝癌细胞体外的增殖能力,有统计学差异(P<0.05),划痕实验、Transwell实验结果显示:与对照组相比,TIGIT si RNA能抑制肝癌细胞体外的迁移和侵袭能力,有统计学差异(P<0.05),流式细胞术结果显示:与对照组相比,TIGIT si RNA能促进肝癌细胞的凋亡,有统计学差异(P<0.05),Western blot结果显示:与对照组相比,TIGIT si RNA组肝癌细胞中TIGIT及肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-9的表达降低,促凋亡蛋白BAX的表达增加而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,裸鼠皮下成瘤实验结果显示:肝癌细胞SMMC-7721在转染TIGIT si RNA后裸鼠皮下肿瘤的生长受到抑制,与对照组相比,肿瘤的体积减少、重量减轻,有统计学差异(P<0.05),免疫组化和Western blot结果显示:经TIGIT si RNA转染后裸鼠瘤体组织中TIGIT的表达水平下降;4.Western blot结果显示:肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721和Bel-7402细胞中CD155高表达,通过将CD155 si RNA转染至肝癌Hep G2、SMMC-7721和Bel-7402细胞,CCK-8实验结果显示:与对照组相比,肝癌细胞的增殖能力降低;流式细胞术结果显示:与对照组相比,肝癌细胞的凋亡能力增强,有统计学差异(P<0.05),Western blot实验结果显示:与对照组相比,肝癌细胞中CD155及与肿瘤迁移侵袭相关蛋白MMP-2、FAK和SRC蛋白表达降低,有统计学差异(P<0.05),促凋亡蛋白BAX的表达增加而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,有统计学差异(P<0.05),裸鼠皮下成瘤实验显示:肝癌细胞SMMC-7721转染CD155 si RNA后裸鼠皮下肿瘤的生长受到抑制,与对照组相比,肿瘤的体积减少、重量减轻,有统计学差异(P<0.05),免疫组化和Western blot结果显示:经CD155 si RNA转染后裸鼠瘤体组织中CD155的表达水平下降。结论1.mi R-206通过靶向TIGI T抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进肝癌细胞的凋亡;2.mi R-206通过靶向T IGI T促进Jurkat T细胞的增殖,抑制Ju rkat T细胞的凋亡;3.TIGI T s i RNA、CD155 si RNA介导了肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡;4.裸鼠皮下成瘤实验显示,靶向TIGI T、CD155的mi R-206、TI GIT si RNA、CD155 si RNA能有效抑制肿瘤的发生和发展。第二部分肝细胞癌患者外周血TIGIT+T细胞的表型和功能变化及其临床意义目的探讨肝细胞癌患者外周血TIGIT+T细胞的表型和功能变化,及其与肿瘤标志物AFP的相关性。方法选取在宁夏医科大学总医院肝胆外科确诊的肝细胞癌患者24例及健康对照14例,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测EDTA抗凝管的外周血:1.CD4+T、CD8+T细胞中TIGI T的表达,2.TIGIT+T细胞记忆效应表型的变化,3.TIGIT+T细胞中共抑制分子的表达,4.TIGIT+T细胞中CD226的表达,5.TIGIT+T细胞的表型变化,6.TIGIT+T细胞趋化因子受体的表达水平及与AFP的相关性,7.TIGIT+T细胞凋亡情况的改变,8.CD8+T细胞分泌细胞因子水平的改变。结果1.HCC患者外周血CD4+T、CD8+T细胞中TIGIT+细胞的百分比显著高于HC组,有统计学差异(P<0.05);2.HCC患者外周血TIGIT+CD45RA-CCR7+CD4+T细胞的百分比低于HC组;TIGIT+CD45RA+CCR7-CD4+T细胞的百分比低于HC组,TIGIT+CD45RACCR7-CD4+T细胞的百分比低于HC组,TIGIT+CD45RA+CCR7+CD4+T细胞的百分比高于HC组,无统计学差异(P>0.05),HCC患者外周血TIGIT+CD45RACCR7+CD8+T细胞的百分比低于HC组,TIGIT+CD45RA+CCR7+CD8+T细胞的百分比低于HC组,TIGIT+CD45RA+CCR7-CD8+T细胞的百分比低于HC组,TIGIT+CD45RA-CCR7-CD8+T细胞的百分比高于HC组,无统计学差异(P>0.05);3.HCC患者外周血TIGIT+CD4+T细胞中PD-1的表达高于HC组,有统计学差异(P<0.05),TIGIT+CD4+T细胞中TIM-3和CTLA-4的表达与HC组相比,无统计学差异(P>0.05),TIGIT+CD8+T细胞中PD-1、TIM-3和CTLA-4的表达高于HC组,无统计学差异(P>0.05);4.HCC患者外周血TIGIT+CD4+T细胞CD226的表达水平高于HC组,无统计学差异(P>0.05),TIGIT+CD8+T细胞CD226的表达水平高于HC组,有统计学差异(P<0.05);5.HCC患者外周血CD4+CD45RA+CD25+CD127lowTreg细胞和CD4+CD45RA-CD25+CD127lowTreg细胞的百分比均高于HC组,无统计学差异(P>0.05),CD4+CD45RA+CD25+CD127lowTreg细胞和CD4+CD45RACD25+CD127lowTreg细胞中TIGIT的表达水平高于HC组,有统计学差异(P<0.05),HCC患者外周血PD-1+TIGIT+Treg细胞和CTLA-4+TIGIT+Treg细胞的百分比高于HC组,无统计学差异(P>0.05),HCC患者TIM-3+TIGIT+Treg细胞的百分比高于HC组,有统计学差异(P<0.05);6.HCC患者外周血TIGIT+CXCR3+CD4+T和TIGIT+CCR6+CD4+T细胞的百分比高于HC组,有统计学差异(P<0.05),TIGIT+CCR4+CD4+T细胞的百分比低于HC组,无统计学差异(P>0.05),TIGIT+CXCR3+CD8+T、TIGIT+CCR4+CD8+T和TIGIT+CCR6+CD8+T细胞的百分比均高于HC组,有统计学差异(P<0.05),TIGIT+CCR6+Treg细胞的百分比高于HC组,有统计学差异(P<0.05),TIGIT+CCR4+Treg细胞的百分比低于HC组,有统计学差异(P<0.05),HCC患者外周血TIGIT+CXCR3+CD4+T和TIGIT+CCR6+CD4+T细胞的百分比、TIGIT+CXCR3+CD8+T、TIGIT+CCR4+CD8+T和TIGIT+CCR6+CD8+T细胞的百分比和TIGIT+CCR6+Treg细胞的百分比与AFP呈负相关,TIGIT+CCR4+Treg与AFP呈正相关,无统计学差异(P>0.05);7.HCC患者外周血TIGIT+CD4+T细胞的凋亡率高于TIGIT-CD4+T细胞,TIGIT+CD8+T细胞的凋亡率高于TIGIT-CD8+T细胞,有统计学差异(P<0.05);TIGIT+T中CD95的表达与TIGIT-T中CD95相比,无统计学差异(P>0.05);8.HCC患者外周血CD8+T细胞中TNF-α和IFN-γ的百分比明显低于HC组(P<0.05);而Granzyme-B和Perforin-A的百分比与HC组相比,无统计学差异(P>0.05);结论1.HCC患者外周血CD4+T、CD8+T、Treg细胞中TIGIT的表达上调;2.HCC患者外周血CD4+T细胞中TIGIT与PD-1共表达,Treg细胞中TIGIT与TIM-3共表达;3.HCC患者外周血TIGIT+CD8+T细胞中CD226表达水平增加;4.HCC患者外周血TIGIT+CXCR3+CD4+T和TIGIT+CCR6+CD4+T细胞的百分比高于HC组;TIGIT+CXCR3+CD8+T、TIGIT+CCR4+CD8+T和TIGIT+CCR6+CD8+T细胞的百分比均高于HC组;TIGIT+CXCR3+Treg和TIGIT+CCR6+Treg细胞的百分比均高于HC组;TIGIT+CCR4+Treg细胞的百分比低于HC组;5.HCC患者外周血TIGIT+CD4+T、TIGIT+CD8+T细胞的凋亡率增加;6.HCC患者外周血CD8+T细胞分泌细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平下降。