1研究背景与目的食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,显著的地域性分布差异是其流行病学的突出特点,并且预后差,中晚期食管癌患者5年生存率仅10%左右。食管癌死亡率居高不下的原因是目前食管癌发生发展的分子机制尚不十分清楚,缺乏用于食管癌高危人群预警和早期诊断的特异分子标志物。近年研究提示,上皮细胞多阶段癌变演进过程中,常异常表达胚胎发育过程中出现的蛋白,这些蛋白在成熟分化的组织中极少表达,利用这些异常蛋白作为肿瘤分子标志物,已被应用到临床肿瘤的早期诊断(如甲胎蛋白等)。本实验室早期利用以2-DE为基础的蛋白质组学技术,对食管癌高发区的胎儿食管和食管癌及癌旁组织的蛋白质组进行比较分析,发现胎儿食管上皮和食管鳞癌组织中均有S100A9、PRXⅥ等蛋白存在。从形态上来看,胎儿食管成熟分化过程与成人食管上皮失分化癌变过程呈相反的变化趋势,胎儿食管在发育过程中,上皮由幼稚单层柱状上皮逐渐分化成熟为复层鳞状上皮,食管癌变过程是由成熟的食管上皮组织在致癌因素作用下,多阶段渐进发展成失分化状态的癌组织,因此比较这两种相反变化过程中分子变化特征及其与食管上皮形态学变化的关系将有助于食管癌变机制的了解。本研究拟在上述研究的基础上,采用常规光镜观察和免疫组化技术对3-9个月不同胎龄胎儿食管、食管癌及癌前病变组织进行观察,对比分析胎儿食管上皮成熟分化过程和食管癌变过程中上皮组织的形态变化特征,探讨S100A9和PRXⅥ在不同胎龄胎儿食管和食管癌中的表达特征及其与食管上皮增殖和分化的关系,旨在加深对食管癌变机制的了解,为食管癌的早期诊断和防治提供理论依据。2材料与方法胎儿食管标本102例(男性32例,女性70例),由河南省食管癌重点开放实验室2006年-2007年收集,胎儿食管标本取自合法流产及米索针剂(前列腺素类)引产正常胎儿,其中胎儿胎龄3个月15例、4个月32例、5个月12例、6个月18例、7个月12例、8个月9例、9个月4例。30例成人食管上皮标本(男性23例,女性7例)来自河南省林州市姚村食管癌医院,平均年龄为61.1±8.31。所有患者在术前均未接受任何化疗或放疗。所有组织均经福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片、进行组织病理学观察。成人食管标本和胎儿食管标本32例(其中男性15例,女性17例,胎龄3个月4例、4个月5例、5个月5例、6个月5例、7个月5例、8个月4例、9个月4例)进行免疫组织学观察。免疫组化方法采用卵白素—生物素—辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法,每例切片随机计数5个高倍视野,取平均值。按阳性细胞所占的百分比分组,阳性细胞数＞5%为阳性表达,阳性细胞数＜25%为低表达,阳性细胞数＞25%为高表达。实验结果采用SPSS10.0统计软件进行Fisher’s精确概率法计算,相关分析采用Spearman等级相关,检验水准α=0.05。3结果3.1组织病理学观察3.1.1食管鳞癌ESCC的组织病理学诊断食管癌组织30例,根据分化程度不同分为高、中、低分化三组,其中高分化鳞癌7例,中分化鳞癌15例,低分化鳞癌8例,伴有基底细胞过度增生(Basiccell hyperplasia,BCH)2例,不典型增生(Dysplasia,DYS)2例,原位癌(Carcinomain situ,CIS)1例。3.1.2不同胎龄胎儿食管上皮组织学变化光镜下对102例不同胎龄(3-9个月)胎儿食管上皮组织进行观察,发现3月份胎儿食管上皮薄厚不均(1-4层细胞),上皮类型为复层柱状上皮,各层细胞无明显形态分化差异,细胞均为矮柱状。4-8月上皮细胞层数5-8层,细胞分裂增殖旺盛,基底细胞层部分区域可厚达3层,细胞排列不整齐,基底层细胞呈矮柱状,胞浆呈强嗜碱性,表层细胞形态多样,有立方形、柱状、扁平状,在立方形、柱状上皮细胞游离面常见到纤毛结构存在。9月上皮细胞层数6-10层,基底细胞层1-2层,细胞排列整齐,表层细胞大多为扁平细胞,纤毛减少。3.1.3胎儿食管腺组织发生及变化食管粘膜下腺:4个月胎龄的食管粘膜固有层中出现了腺体导管,6个月胎龄的胎儿食管中,腺导管进一步变长穿过粘膜肌层,并在食管的粘膜下层观察到腺泡出现。食管贲门腺:4个月胎龄的胎儿食管下段上皮中出现成簇的柱状上皮细胞,7个月胎龄的胎儿食管下段见到这些柱状细胞逐渐下陷至固有层,并在食管下段固有层中看到腺体形成。3.1.4胎儿食管上皮与癌前病变、食管癌形态学对比3.1.4.1上皮细胞增生从胎儿食管上皮发育情况来看,胎儿食管上皮通过基底细胞增殖分化成熟为有稳定分区的复层鳞状上皮,特别是4-8月份的胎儿食管上皮基底层细胞增生活跃,部分区域细胞可达2-4层,基底细胞呈立方形或矮柱状、核圆形、胞质呈强嗜碱性。从形态学上对比,胎儿食管上皮增生情况与食管癌前病变BCH、DYS有很大相似之处,但上皮厚度远低于BCH、DYS。3.1.4.2基底膜胎儿食管上皮在发育过程中基底膜由无→有→波浪形突起,而食管癌在癌变过程中,食管上皮基底膜由明显→不明显→消失,两过程相反。3.1.4.3凋亡细胞在胎儿食管上皮细胞之间散在分布有凋亡细胞,在快速增殖的食管癌上皮中也常见到凋亡细胞的存在。3.2免疫组织化学结果3.2.1 S100A9蛋白S100A9在食管上皮细胞内着色部位为胞浆和胞膜。在胎儿食管上皮中的表达部位主要在上皮的浅表层,基底层细胞常无阳性表达。S100A9在胎儿食管上皮中总阳性率为65%(21/32),在胎儿食管上皮中的表达随胎儿胎龄增加呈升高趋势,差异有统计学意义(P＜0.05)。在正常食管上皮细胞中S100A9表达呈强阳性,但基底层细胞无阳性表达。在癌前病变组织和癌组织中阳性表达减弱,中、低分化食管鳞癌比高分化食管鳞癌细胞表达水平更低甚至缺失,在食管癌中S100A9阳性率为73%,S100A9在不同分化程度食管癌组织中的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。S100A9表达与食管癌分化程度有明显的相关性(r=0.507)。3.2.2 PRXⅥ蛋白PRXⅥ在胎儿食管上皮中呈强阳性表达,上皮浅表层阳性表达最强,总阳性率为72%(23/32),PRXⅥ阳性表达强度及阳性率在胚胎早期随胎儿胎龄增加呈升高趋势,5-6份达到最高,而后随胎儿胎龄增加阳性率有所下降,PRXⅥ表达差异有统计学意义(P＜0.05)。在食管鳞癌中PRXⅥ阳性率为13%(4/30),且呈弱阳性表达,PRXⅥ在不同分化程度食管癌组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。4结论4.1胎儿食管基底细胞层旺盛的增殖状态、基底膜变化、凋亡细胞的出现,与成人食管癌变过程有极相似的形态变化特征。4.2 S100A9蛋白在胎儿食管上皮中的表达随上皮成熟分化程度增强而增强,而在成人食管上皮失分化癌变过程中,依次从BCH→DYS→CIS→高分化SCC→中分化SCC→低分化SCC其免疫阳性细胞数呈降低趋势。提示:S100A9可能参与了细胞的分化过程。4.3 PRXⅥ蛋白在胎儿食管上皮和食管癌组织中均有表达提示:作为抗氧化酶,其在快速增殖的组织中可能起到消除代谢产生的过氧化物、保护细胞免受损伤的作用。