真菌病害是限制牧草生长的主要因素之一,每年由于真菌病害给牧草和草坪草带来了很大的经济损失.造成牧草产量下降,品质变劣;草坪草褪色、黄化甚至枯死,影响草坪质量降低利用年限.传统的对真菌防治方法采用施用杀菌剂和农药,这会带来环境的污染,危害人类的身体健康.而基因工程技术的兴起,为我们提供了新的研究方法.本研究采用RT-PCR方法,从萝卜叶片中提取总RNA进行反转录得到cDNA,通过设计PCR扩增特异,克隆得到抗真菌肽(antifungal protein)基因,与pUC<,m>-T easy vector连接,转化E.coli DH5 α,得到重组子pUC<,m>AFP,经酶切和序列分析鉴定,改片段分子大小为240bp,通过序列对比分析发现与genebank中已发表的AFP碱基序列一致,有100.00﹪的同源性,将其序列翻译成蛋白没有终止子的出现,表明可以进行原核表达和植物载体转化实验.将此抗真菌肽基因克隆到E.coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 OD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达.从水稻叶片中提取基因组DNA,设计PCR扩增特异引物,克隆单子叶特异表达启动子Actinl基因,与pUC<,m>-T easy vector连接,转化E.coli DH5 α,得到重组子pUC<,m>Act,经酶切和序列分析鉴定,该片段分子大小为1238bp,通过序列对比分析发现与己发表的Actinl碱基序列有99.60﹪的同源性.构建Actinl启动子基因驱动的AFP基因单子叶植物表达载体,进行早熟禾的遗传转化;将AFP基因插入载体pBI121构建了双子叶植物表达载体,进行苜蓿的遗传转化,得到卡那霉素抗性初步筛选的转化苗.为深入开展草业抗真菌转基因研究奠定了基础.