马尔尼菲篮状菌通过精氨酸代谢影响巨噬细胞极化和杀伤的机制

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目的:探究马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)通过精氨酸代谢影响巨噬细胞极化和杀伤的机制。方法:(1)构建静息巨噬细胞(Mφ)与TM分生孢子体外共培养模型、LPS刺激的巨噬细胞(Mφ+LPS)与TM分生孢子体外共培养模型,在共培养24h、48h、72h时,通过荧光定量PCR检测巨噬细胞iNOS、Arg1、TNF-α、IL-10、CD301、IL-1β的mRNA相对表达量;通过蛋白印迹法检测巨噬细胞iNOS、Arg1、CD86、IL-4R的蛋白表达;通过生化法检测巨噬细胞的精氨酸酶活性;通过微板法检测共培养上清液中NO的含量;通过免疫荧光检测巨噬细胞CD86、CD206的荧光表达强度。(2)精氨酸酶特异性抑制剂N-羟基-正-L 精氨酸(Nω-hydroxy-nor-L-arginine,nor-NOHA)预处理 LPS刺激的巨噬细胞2h,与TM分生孢子共培养24h,通过生化法检测巨噬细胞的精氨酸酶活性;通过微板法检测共培养上清液中NO的含量;通过蛋白印迹法检测巨噬细胞iNOS、Arg1的蛋白表达;通过吞噬指数检测巨噬细胞吞噬TM分生孢子的能力;通过平板菌落计数检测巨噬细胞杀灭TM的能力。结果:(1)①荧光定量PCR显示:Mφ/Mφ+LPS与TM共培养组的iNOS、Arg1、TNF-α、IL-10、CD301、IL-1β mRNA 相对表达量高于 Mφ/Mφ+LPS组,P<0.05,并且随着共培养时间的延长呈现不同的变化趋势;②蛋白印迹法显示:Mφ/Mφ+LPS与TM共培养组的Arg1、CD86的蛋白表达低于Mφ/Mφ+LPS 组,iNOS、IL-4R 的蛋白表达高于 Mφ/Mφ+LPS 组,P<0.05;③生化法显示:Mφ/Mφ+LPS与TM共培养组的精氨酸酶活性高于Mφ/Mφ+LPS组,共培养时间越长、活性越高,P<0.05;④微板法显示:Mφ/Mφ+LPS与TM共培养组的NO含量低于Mφ/Mφ+LPS组,P<0.05;⑤免疫荧光显示:Mφ/Mφ+LPS与TM共培养组的CD206荧光表达强度高于Mφ/Mφ+LPS组,CD86的荧光表达强度与Mφ/Mφ+LPS组无明显差异。(2)①生化法显示:添加20 μ M nor-NOHA预处理后共培养组的精氨酸酶活性低于未添加组,P<0.05;②添加20μ M nor-NOHA预处理后共培养组的NO含量高于未添加组,P<0.01,;③蛋白印迹法显示:添加20μ M nor-NOHA预处理后共培养组的Arg1的蛋白表达低于未添加组,iNOS的蛋白表达高于未添加组,P<0.01;吞噬指数显示:添加20μ M nor-NOHA预处理后巨噬细胞吞噬TM分生孢子的数量多于未添加组,P<0.05;⑤平板菌落计数法显示:在共培养体系中添加20 μ M nor-NOHA预处理的巨噬细胞杀伤TM的能力强于未添加组;单独培养TM时,添加20μ M nor-NOHA预处理的TM的数量少于未添加组;共培养体系中TM的数量多于单独培养的TM的数量。结论:(1)TM通过升高巨噬细胞的精氨酸酶活性,减少NO的合成并诱导巨噬细胞向M2型极化,以此逃避巨噬细胞的氧化杀伤,促使自身在宿主体内的持续感染。(2)精氨酸酶抑制剂nor-NOHA可以降低TM诱导的高精氨酸酶活性,增加巨噬细胞的NO产量,增强巨噬细胞杀伤TM的能力。(3)精氨酸酶抑制剂nor-NOHA对TM的生长有抑制作用。
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