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前言MicroRNA (miRNA)是一类长度约为21-24个核苷酸的非编码小分子RNA。miRNA通过完全互补或部分互补方式识别靶基因3’-UTR,直接降解靶mRNA或抑制其翻译,而抑制靶基因表达,调控细胞凋亡、增殖和分化。因此,miRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。miR-125a是miRNA家族成员之一,存在前体和成熟体两种形式,其成熟体具有生物学活性。目前发现其有两种成熟体miR-125a-3p与miR-125a-5p。本课题组前期实验发现miR-125a-3p/5p在肺癌细胞中与HBE相比呈低表达,转染正义miR-125a-3p/5p能使肺癌A549细胞内miR-125a-3p/5p含量增加,促进A549细胞凋亡,同时野生型p53表达也随之升高,而转染反义miR-125a-3p/5p则与之相反,但其调控机制尚不清楚。因此,我们认为miR-125a-3p/5p可能通过调控野生型p53促进A549细胞凋亡。利用多种预测软件通过对miR-125a-3p/5p可能作用的靶基因进行预测发现,能抑制p53的癌基因MDM2可能是miR-125a-3p/5p的共同靶基因；Bcl-w基因可能是miR-125a-3p/5p共同靶基因、Bcl-2基因可能仅是miR-125a-5p靶基因。p53是目前研究比较深入的促凋亡因子；Bcl-w、Bcl-2是Bcl-2家族成员,二者均为凋亡抑制因子。因此,我们推测miR-125a-3p/5p可能是通过MDM2/p53、Bcl-w、Bcl-2途径调控肺癌细胞凋亡。本实验将通过转染正义或反义miR-125a-3p/5p增加或下调其在细胞内水平,研究其对肺癌细胞表达MDM2/p53、Bcl-w、Bcl-2影响,进一步揭示其调控凋亡的分子机制,为治疗肺癌提供新的途径。材料与方法1、材料与试剂人肺腺癌细胞A549、H1299(p53阴性)。成熟miR-125a序列：正义miR-125a-3p:5’-ACA GGU GAG GUU CUU GGG AGC C-3’;反义miR-125a-3p:5’-GGC UCC CAA GAA CCU CAC CUG U-3’;乱序miR-1:5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUA A-3’;正义miR-125a-5p:5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UG-3’;反义miR-125a-5p:5’-CAC AGG UUA AAG GGU CUC AGG GA-3’;乱序miR-2:5’-GGA CGG CGA UCA GAU AAG AGU UC-3’;每个碱基都进行了2’-0甲基化修饰以保持RNA序列的稳定性,无荧光标记。2、实验方法2.1细胞培养：10%胎牛血清的DMEM(Gibco, USA)和RPMI-1640(Gibco, USA)培养,37℃、5%的CO2。2.2 Real time PCR:提取细胞总RNA,根据TaqMan(?)MicroRNA Reverse Transcription Kit (P/N:4366596, Applied Biosystems)试剂盒和TaqMan(?)MicroRNA Assays HAS-MIR-125A (P/N:4380904, Applied Biosystems)按说明书操作。所有反应均设置三个复孔。2.3瞬时转染：培养细胞至亚融合状态,转染正义或反义miR-125a-3p/5p和乱序组miR-1/2溶液(20uM)LipofectamineTM 2000混合液加入到孔板中。37℃、5% CO2条件下培养4-6小时后将培养基换液,根据需要培养24-72小时。2.4 RT-PCR:提取细胞总RNA,按RT-PCR (TaKaRa)试剂盒方法进行反应。PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行检测,采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。2.5 Western Blot:采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量,ECL显色。Western Blot实验结果经凝胶成像系统采集,进行灰度值测定,β-actin为内对照,重复三次。2.6流式细胞术(Annetin V-FITC双染法)：每种细胞转染后分成四组：空白对照组、加Annetin V组、加FITC组和加Annetin V+FITC组。在BD FACSCaliburTMFlow Cytometer (BD Biosciences)上检测细胞凋亡情况。3、统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件,对细胞实验结果采用t检验进行数据分析,用mean±SD表示,P<0.05为有统计学意义。结果1、转染正义或反义miR-125a-3p/5p对A549细胞中miR-125a-3p/5p表达水平和凋亡影响在A549细胞中分别转染正义或反义miR-125a-3p/5p,用乱序组和空转染组作对照,转染24h后,用Real-time PCR方法检测miR-125a-3p/5p表达水平、用流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示：转染正义miR-125a-3p/5p组细胞中miR-125a-3p/5p表达水平和细胞凋亡率均比乱序组和空转染组明显增高(P<0.01)；转染反义miR-125a-3p/5p组细胞中miR-125a-3p/5p表达水平和细胞凋亡率均比乱序组和空转染组明显降低(P<0.01)；乱序组和空转组与未处理组相比,miR-125a-3p/5p表达水平和细胞凋亡率均无明显变化(P>0.05)。2、正义或反义miR-125a-3p/5p对A549细胞表达MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2的影响在A549细胞中分别转染正义或反义miR-125a-3p/5p 24h后,通过RT-PCR和Western Blot方法检测MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2等mRNA和蛋白表达情况。结果显示：正义miR-125a-3p/5p组细胞中p53 mRNA和蛋白表达升高,Bcl-w mRNA和蛋白表达降低,MDM2 mRNA无变化而蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA和蛋白无变化；转染反义miR-125a-3p/5p组细胞中p53 mRNA和蛋白表达降低,Bcl-w mRNA和蛋白表达升高,MDM2 mRNA无变化而蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA和蛋白无变化。上述结果提示：miR-125a-3p/5p可能通过抑制MDM2表达进而上调p53表达,促进细胞凋亡；或同时抑制Bcl-w表达促进细胞凋亡。3、阻断p53或Bcl-w后,miR-125a-3p/5p对A549细胞凋亡影响为了明确miR-125a-3p/5p是否通过p53和／或Bcl-w途径调控细胞凋亡,在转染正义miR-125a-3p/5p同时用单克隆抗体封闭野生型p53 24h；在转染反义miR-125a-3p/5p同时用单克隆抗体封闭Bcl-w 24h,用流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示：正义miR-125a-3p/5p引起的细胞凋亡通过阻断p53后受到不同程度的抑制(P<0.05),其中阻断p53对正义miR-125a-5p引起的细胞凋亡抑制作用比miR-125a-3p显著(P<0.05)；转染反义miR-125a-3p/5p引起的细胞凋亡抑制通过阻断Bcl-w后有不同程度恢复(P<0.05),其中阻断Bcl-w对反义miR-125a-3p的作用比对反义miR-125a-5p的作用显著(P<0.05)。为了进一步明确野生型p53和Bcl-w在miR-125a-3p/5p诱导A549细胞凋亡中所起的作用是否不同,我们选择p53阴性肺癌细胞系H1299,转染正义和反义miR-125a-3p/5p 24h,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示：正义miR-125a-3p比正义miR-125a-5p引起的细胞凋亡显著增高(P<0.01);反义miR-125a-3p比反义miR-125a-5p抑制细胞凋亡显著降低(P<0.05)。上述结果表明：miR-125a-5p可能主要通过调控MDM2/p53途径促进细胞凋亡,而miR-125a-3p可能主要通过调控Bcl-w途径促进细胞凋亡。结论1、miR-125a-3p/5p可以通过抑制MDM2,上调野生型p53表达；同时抑制Bcl-w表达,促进肺癌细胞凋亡。2、miR-125a-5p可能主要通过调控MDM2/野生型p53途径促进肺癌细胞凋亡,miR-125a-3p可能主要通过抑制Bcl-w促进肺癌细胞凋亡。