第一部分目的：内镜粘膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）是消化道早期肿瘤病变的首选治疗方法，它普及的重要障碍在于手术的操作难度较大和穿孔的发生率较高。通过消化道粘膜下注射形成一个粘膜下液体垫层（submucosal fluid cushion,SFC）是避免穿孔的最好方法，因此合适的注射材料成为改进这种微创内镜技术的重要环节。在本研究中，我们将一种可注射的热致水凝胶的生物材料作为新型的粘膜下注射材料尝试用于ESD术中，以观察可行性、安全性、持久性和组织相容性。方法：这种水凝胶成分是聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸三嵌段共聚物Poly(lactic acid-co-glycolic acid)-poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid-co-glycolicacid)(PLGA-PEG-PLGA)，这种高分子水凝胶溶液在室温下是一种粘性液体，因此可以注射，在注射到体内之后接触体温，变成一种不能流动的凝胶。我们在活体外和活体内分别将这种热致水凝胶进行粘膜下注射，来评估它的生物安全性、注射可行性、粘膜隆起的高度和时间以及对ESD手术的帮助。具体来说，合成该水凝胶溶液之后，将该溶液经皮下注射到小型猪的后腿内侧，观察皮下隆起灶形成情况；购买新鲜的离体猪胃，分别抽取水凝胶溶液和甘油果糖、透明质酸注射到胃的粘膜下层，在不同时间点评价不同的注射剂形成的粘膜隆起，相机拍照记录；将活体小型猪麻醉后，通过内镜腔道，采用内镜注射针，将三种注射剂注射（水凝胶溶液、甘油果糖和透明质酸）到粘膜下层，形成的粘膜隆起在0，15，30min和1周时通过内镜观察，留取相应内镜图片，1周后处死取材做HE染色评价，光学显微镜观察；将活体小型猪麻醉后，使用该水凝胶溶液进行粘膜下注射并进行ESD手术，3只立即处死以检查组织急性损伤，另2只1周后处死以观察迟发性组织损害。粘膜下注射和ESD手术部位的胃黏膜组织用福尔马林固定，石蜡包埋后HE染色，光镜观察。结果：在将热致水凝胶溶液皮下注射到猪的大腿内侧之后，注射部位因为生理体温所致的快速凝胶化（约30s）在注射后形成明显的椭圆形隆起，它的形状保持时间超过了1月，高度和大小因为胶体的活体内降解逐渐减小，没有观察到红肿热痛、坏死等副作用；在离体猪胃的粘膜下注射实验中，虽然3种注射液注射之后都产生了明显的粘膜隆起，但水凝胶形成的SFC明显更为持久，观察60分钟之后没有见到水凝胶的粘膜隆起灶的大小、外形和硬度有明显变化，相反，其他两者的隆起在15min之后逐渐塌陷；在活体猪的粘膜下注射实验中，三种溶液都造成了明显的粘膜隆起灶，在刚注射完毕时，三者形成的粘膜隆起外形明显，高度上没有明显的差异，但透明质酸和甘油果糖注射完毕15min之后粘膜隆起逐渐塌陷，到了30min时候，内镜下已经观察不到粘膜隆起灶，相反，水凝胶形成的粘膜隆起的外形和清晰边界在30min时都没有改变，1周之后水凝胶形成的粘膜隆起仍然清楚存在且边界清晰，局部没有缺血征象或者溃疡，病理显示没有明显的上皮损伤，也没有观察到炎症细胞；在活体猪的ESD实验中，所有的ESD手术都成功完成，当用电刀切开粘膜隆起灶时，隆起灶的环周切除能够很方便地完成，接下来，粘膜下形成的胶体很容易地就通过内镜吸取孔道被吸走，粘膜下形成一个干净的空腔，最终病变用圈套器被完整的整块切除下来，整个过程中无需任何重复注射，没有发生大量出血和穿孔等严重并发症，病理没有观察到除手术切缘以外其他部位粘膜和固有肌层的损伤，炎症仅停留在浅层。结论：在该凝胶的协助下，ESD手术能够精确地施行病变的整块切除，并且显著缩短了手术时间。同时，没有发生大出血、穿孔和组织损伤等并发症。该凝胶的使用不仅使得ESD程序变得简便，也增加了ESD的有效性和安全性。PLGA-PEG-PLGA热致水凝胶适合作为一个理想的粘膜下注射材料来形成更高的粘膜抬举和维持更长抬举时间，从而减少了并发症。它的独特的粘膜下剥离功能简化了ESD的操作步骤，避免了传统方法中繁琐冗长的剥离过程，因此有利于ESD手术的普及和应用。第二部分目的：隧道内镜是一种创新的内镜技术，在包括经口内镜食管括约肌切开术(peroral endoscopic myotomy, POEM)在内的多种内镜手术中起到核心作用。但目前的隧道内镜技术仍然复杂而费时，而且在某些解剖部位和病理情况下无法成功建立粘膜下隧道(submucosal tunnel, SMT)，这大大限制了它的临床应用，亟待开发能够解决这些局限性的新方法。PLGA-PEG-PLGA热致水凝胶溶液在我们的前期研究中已经证实了在ESD手术中，它是一种很好的粘膜下注射材料，因此本研究进一步评价它在消化道粘膜下隧道建立过程中的作用。方法：小型猪禁食麻醉后，经猪的肛门将1个三腔二囊管插入结肠，生理盐水冲洗以建立清洁的肠段。在3头小型猪的食管、胃、结肠依次采用PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液作为粘膜下注射液来建立粘膜下隧道，将内镜通过口部或肛门插入消化道并到达手术部位，选择合适的位置通过一个注射针进行水凝胶溶液的粘膜下注射，然后在垫层的一侧用内镜电刀做一个1.5cm左右的横行切口，然后内镜进入粘膜下空间并通过吸引孔道吸引凝胶逐渐前进，视频记录整个操作过程，评价可行性和并发症。手术完成之后，处死所有的猪并进行病理解剖，同时，在进行粘膜下注射之后尽快取消化道粘膜组织，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。结果：所有3只猪的食管、胃和结肠均成功建立隧道，没有并发症发生。食管隧道的位置位于距门齿约20-25cm处，胃隧道的位置位于胃体，结肠隧道的位置位于距肛门15-20cm左右的肠段。在食管、胃、结肠建立每个隧道所需要的注射胶的体积约为20ml，每次粘膜下注射都形成了一个厚的粘膜下垫层，在切开粘膜隆起灶之后，带帽的内镜顺利的进入粘膜下空间并吸取胶体，凝胶基本吸取干净后隧道自然形成，无需使用电刀剥离或者钝性分离。在三个部位建立隧道的中位操作时间分别是13.6,11.5和9.4分钟。形成的隧道长度约5cm。解剖没有发现明显的粘膜层和固有肌层的撕裂伤，也没有邻近器官的损伤。结论：我们的初步实验证实了PLGA-PEG-PLGA热致水凝胶溶液作为一种新的粘膜下注射来建立胃肠道SMT是安全可行的，未来需要进行一系列的对照研究来比较它与目前临床上常用的粘膜下注射物质对手术疗效的影响。第三部分目的：经自然腔道内镜手术(natural orifice transluminal endoscopic surgery，NOTES)是近年兴起的一类新型手术类型，它使微创手术从腹壁无可见瘢痕变为真正的无瘢痕，彻底消除了腹壁切口以及相关的切口感染、疼痛、切口疝等问题，患者术后恢复快，心理应激程度低，费用也低。但是内镜在进行NOTES手术时有一些固有的缺陷：内镜镜身柔软，轴向力不足，在进行腹腔内分离时操作起来很困难，分离过程成为内镜进行NOTES手术中最耗时和风险最大的步骤，开发能够帮助内镜在腹腔内分离过程的方法，有利于NOTES的发展和应用。我们的前期研究用PLGA-PEG-PLGA热致水凝胶溶液作为粘膜下注射液，可以极大地方便ESD手术和消化道隧道的建立，受此启发，我们提出设想：如果在NOTES手术进入腹腔之前，用EUS的定位优势将此类凝胶直接注射到手术的目标区域附近，溶液固化后因其本身的占位效应，形成一个直达手术目标的胶体通路，然后NOTES进入腹腔后通过吸走固化的凝胶，从而形成一个直达手术目标的“隧道”，从而省去了费时和复杂繁琐的腹腔内剥离过程，简化了手术过程。因此，我们利用热致水凝胶溶液尝试在动物身上进行这种基于腹腔内生物材料注射的NOTES-腹腔神经丛松解术(celiac plexus neurolysis, CPN)，研究其可行性和安全性。方法：活体小型猪禁食麻醉后，将超声内镜通过猪口插入，在EUS实时监测下将穿刺针刺入，注射胶约30ml。接着沿食道下方用常规隧道技术打一隧道，切开后进入腹腔，发现凝胶位置后在蓝色凝胶块的一侧用内镜电刀切开，内镜镜头进入胶块内空间，通过吸引孔道吸走凝胶，边吸引边前进，直到看到腹腔干和腹主动脉汇合处，前进过程中避免暴力分离，以防出血影响视野，少量出血采用电活检钳进行电凝处理。腹腔干和腹主动脉汇合处附近即为腹腔神经节的位置。采用电活检钳电凝周围组织。视频记录整个操作过程，评价可行性和并发症。手术完成之后，处死所有的猪并进行病理解剖，仔细检查手术部位和附近的器官有无损伤。结果：所有三头猪均成功完成这种方式的NOTES-CPN手术，没有明显的并发症（穿孔或者大出血）。注射所用的水凝胶溶液平均体积为36ml (range25-28ml)。每次粘膜下注射都形成了一个半球状的蓝色凝胶团块。带帽的内镜进入团块内空间之后，凝胶很容易就被吸走，从而形成一个内镜前进的隧道。无需电刀剥离或者其他形式的钝性分离即可到达手术部位。在病理解剖时没有看到粘膜层或者固有肌层的撕裂伤，邻近器官组织也没有任何损伤。操作的平均时间是35mins (range28-41mins)。结论：本研究中我们成功地将一种对温度敏感可逆的PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液作为一种腹腔内注射材料来引导NOTES手术中内镜快速到达目标区域。因此，PLGA-PEG-PLGA热致水凝胶除了可作为内镜粘膜下注射液之外，它的胶化特性和生物相容性使得它可以作为体内手术的标志物和引导物，在NOTES等新兴手术中可能也有更大的应用范围。