血管生成是通过已有的血管发芽而形成新血管的过程,胚胎发育完成后生理性与病理性血管均通过此过程产生。生理性的血管生成对损伤修复、组织的生长和再生都十分关键,而生理性血管的异常生成和病理性血管的形成往往与许多疾病的发生有关。视网膜血管作为视网膜中氧气和营养供应的通道,其异常发育会诱发许多眼病,如家族性渗出性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等。目前对于这些疾病仍缺少有效的诊疗方法,寻找影响血管生成的基因,明确生理性血管发育与病理性血管生成的机制,对于这些疾病的诊疗具有重要意义。本论文研究了三个基因在视网膜血管生成中的作用,并对其调控机制进行了研究,为血管性眼病的治疗提供了参考。论文的主要内容如下:1.首次就TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其机制进行了研究。研究发现,人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常。另外,在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Tmem30a导致视网膜表层血管发育迟缓、密度降低,血管末端膨大,顶端内皮细胞的数量减少,丝状伪足数目降低;在小鼠全身敲除Tmem30a还会导致血管壁的完整性遭到破坏。而在小鼠视网膜血管发育完成后敲除Tmem30a不会影响血管网络的维持。在转录水平进行分析发现在敲减TMEM30A的人视网膜血管内皮细胞与全身敲除Tmem30a小鼠的肺组织中与细胞周期有关的基因表达量减少;同时蛋白质免疫印迹分析发现其中涉及VEGF信号传导的相关蛋白质的磷酸化水平也明显降低。以上结果表明,Tmem30a在血管生成和维持血管屏障的完整性中发挥了作用,其通过调节VEGF的信号传导来控制血管生成。2.研究了TWIST1基因在视网膜病理性血管生成中的作用。研究发现在血管内皮细胞条件性过表达Twist1的小鼠中出现了视网膜表层血管发育迟缓、前端异常增生和局部渗漏的表型。免疫荧光染色发现该小鼠血管内皮细胞增殖速度显著加快,小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达增多,血管内皮生长因子分泌异常。而血管内皮细胞核染色显示血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠血管内皮细胞核多为椭圆形,且不指向无血管区。该结果说明Twist1过表达导致星形胶质细胞的异常激活,其分泌的血管内皮生长因子随之升高,进一步导致了血管的异常增生,同时Twist1过表达后引起的血管内皮细胞极性的丧失会导致血管发育迟缓。而在小鼠视网膜血管发育完成后过表达Twist1不会影响血管网络的维持。另外,全身过表达Twist1后,小鼠眼球变小,视网膜表层血管发育迟缓、密度下降、局部渗漏,与在血管内皮细胞过表达Twist1的表型不同,说明Twist1在其他细胞中同样发挥作用。体外荧光素酶实验发现过表达TWIST1导致Norrin/β-catenin信号通路活性增强。以上结果表明TWIST1可能通过异常激活Norrin/β-catenin信号通路导致视网膜病理性新生血管的生成。3.鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1,并对其致病机制进行了研究,首次将DLG1与FEVR相关联,进一步明确了DLG1影响血管生成的作用机制。研究表明DLG1的错义突变S598G使DLG1无法正常激活β-catenin信号的传导,血管形成实验表明敲减DLG1影响了人视网膜血管内皮细胞的管腔形成,蛋白免疫印迹实验证明了DLG1缺失后VEGFR2蛋白磷酸化水平降低。综上,本研究阐明了TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其分子机制,证实了TWIST1在病理性血管生成中的作用,鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1。为血管性眼病及其他病理性血管生成疾病的治疗提供了新的药物治疗靶点。