论文部分内容阅读
砷（As）是自然界中广泛存在,并具有类金属特性的元素。亚砷酸钠（NaAsO2）是砷元素在环境中存在的主要形式并且其分布十分广泛。流行病学研究已经证实,砷化物的暴露可以引起肺,皮肤,肝,肾,膀胱肿瘤。同时,砷化物也被用作治疗白血病等癌症的药物。但是,对其致癌及抗癌机制目前仍然不清楚。不同浓度NaAsO2引起不同水平的活性氧（ROS）升高,两者之间存在较好的正相关关系。ROS除了是一种破坏性强大的毒性物质即引起机体生物大分子氧化性损伤,造成细胞变性、坏死以外,适量的ROS还是对细胞具有广泛调节功能,参与细胞信号转导、激活转录因子,影响基因表达,从而使细胞产生自我保护作用的调节分子。p53被认为是细胞应激的关键性调控分子之一,在细胞内扮演重要的监控角色,能够整合细胞内和细胞外各种应激信号并对此产生反应。已研究发现p53可以直接与某些DNA损伤修复过程中的关键蛋白相互作用或作为转录因子上调修复过程中的某些蛋白表达,从而提高细胞DNA损伤修复能力。本研究选用人胚肺成纤维细胞（HELF）和人角质化细胞（HaCaT）作为细胞模型,探讨低浓度0.1和0.5μM NaAsO2对两种细胞ROS水平、DSBs损伤、细胞凋亡和p53表达的影响及其相互关系;并在观察不同浓度MMS所致DSBs损伤基础上,探讨低浓度0.1和0.5μM NaAsO2对MMS所致两种细胞DSBs损伤的影响;然后应用ROS拮抗剂过氧化氢酶和p53特异抑制剂Wortmannin预处理后再观察低浓度0.1和0.5μM NaAsO2所致ROS水平和对MMS所致DSBs损伤的影响,从而探讨ROS和p53在低浓度NaAsO2拮抗MMS所致细胞DSBs损伤中的作用,为深入研究砷化物对机体和组织细胞影响及其分子机制研究提供科学线索。方法一、低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞ROS水平的影响用0、0.1和0.5μM NaAsO2处理HELF和HaCaT细胞6 h,根据DCFH-DA方法用多功能酶标仪测定ROS荧光强度,以检测细胞ROS水平。二、低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞凋亡和DSBs损伤的影响用0、0.1和0.5μM NaAsO2处理HELF和HaCaT细胞6 h,用Hoechest33258对细胞核进行染色,荧光显微镜下观察细胞核形态,细胞核出现致密浓染者为凋亡细胞,计数细胞凋亡率。用Western blot方法检检测细胞凋亡指标断裂caspase-3表达和DSBs损伤指标γ-H2AX表达。三、不同浓度MMS所致HELF和HaCaT细胞DSBs损伤用0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM MMS分别处理HELF和HaCaT细胞6 h后,用Western blot法检测HELF和HaCaT细胞特异性DSBs损伤蛋白γ-H2AX表达。四、低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞p53表达的影响及其与ROS关系分别用0、0.1和0.5μM NaAsO2分别处理HELF和HaCaT细胞6 h后,用免疫荧光和Western blot两种方法分别检测p53表达情况。并应用0.1μM NaAsO2和细胞内ROS拮抗剂过氧化氢酶联合处理HELF和HaCaT细胞后,用Western blot方法检测p53表达,以探讨低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞p53表达的影响及其与ROS关系。五、低浓度NaAsO2对MMS所致HELF和HaCaT细胞DSBs损伤和p53表达的影响用0.1和0.5μM NaAsO2预处理HELF和HaCaT细胞6 h后,再用0.6 mM MMS处理细胞6 h,Western blot法检测细胞p53表达和DSBs损伤指标γ-H2AX表达。六、p53抑制在低浓度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs损伤中的作用HELF和HaCaT细胞分别先用10μM Wortmannin或/和0.1μM NaAsO2预处理6 h后,再用0.6 mM MMS处理6 h,Western blot检测HELF和HaCaT细胞p53表达和DSBs损伤指标γ-H2AX表达。结果一、低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞ROS水平的影响低浓度0.1和0.5μM NaAsO2处理HELF和HaCaT细胞均引起ROS荧光强度显著高于对照组（p<0.05）,说明低浓度0.1和0.5μM NaAsO2可以引起细胞ROS水平一定程度升高。二、低浓度NaAsO2对HELF和HaCaT细胞凋亡和DSBs损伤的影响用0、0.1和0.5μM NaAsO2分别处理HELF和HaCaT细胞6 h后,用Hoechst33258染色检测HELF和HaCaT细胞凋亡率,用Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白断裂caspase-3和DSB损伤指标γ-H2AX表达。结果显示,低浓度0.1和0.5μM NaAsO2处理组与对照组相比细胞凋亡率无显著性差别（p>0.05）,且低浓度0.1和0.5μM NaAsO2处理组也未检测到断裂caspase-3表达和γ-H2AX表达,从而说明低浓度0.1和0.5μM NaAsO2未引起HELF和HaCaT细胞DSBs损伤和细胞凋亡。三、不同浓度MMS对HELF和HaCaT细胞DSBs损伤的影响用0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM MMS分别处理HELF和HaCaT细胞6 h后,用Western blot方法检测细胞DSBs损伤指标γ-H2AX表达情况。结果显示,MMS引起了明显的γ-H2AX表达升高,并呈浓度-效应关系,从而说明,不同浓度MMS可明显引起DSBs损伤。四、低浓度NaAsO对HELF和HaCaT细胞p53表达的影响及其与ROS关系低浓度0.1和0.5μM NaAsO2明显诱导p53表达升高;而0.1μM NaAsO2和细胞内ROS拮抗剂过氧化氢酶预处理HELF和HaCaT细胞后,发现0.1μM NaAsO2可明显提高p53表达,而这种p53表达升高可以被过氧化氢酶所拮抗。从而说明低浓度NaAsO2刺激HELF和HaCaT细胞p53表达升高是通过ROS实现的。五、低浓度NaAsO2对MMS所致DSBs损伤和p53表达的影响用0.1和0.5μM NaAsO2预处理HELF和HaCaT细胞6 h后,再用0.6 mM MMS处理6 h,用免疫荧光和Western blot法检测p53表达和DSBs损伤指标γ-H2AX表达。免疫荧光和Western blot结果均显示,低浓度0.1和0.5μM NaAsO2预处理组γ-H2AX表达明显低于MMS单独处理组;而p53表达在0.1μM NaAsO2和MMS联合处理组表达明显高于其它组。从而说明低浓度NaAsO2可明显拮抗MMS所致DSBs损伤,而且p53可能在其中发挥重要作用。六、p53抑制剂Wortmannin和低浓度NaAsO2对MMS所致DSBs损伤的影响用10μM Wortmannin或/和0.1μM NaAsO2预处理HELF和HaCaT细胞6 h后,再用0.6 mM MMS 6 h。Western blot结果显示,在两种细胞中Wortmannin预处理组p53表达最低,而0.1μM NaAsO2和MMS联合处理组p53表达最高;在两种细胞中Wortmannin预处理组DSBs损伤指标γ-H2AX表达最高,而0.1μMNaAsO2和MMS联合处理组DSBs损伤指标γ-H2AX表达最低。从而说明p53被抑制可阻止低浓度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs损伤效应,进一步证明p53在低浓度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs损伤作用中发挥重要作用。结论1、低浓度NaAsO2可以诱导HELF和HaCaT细胞产生一定水平的ROS,但未引起DsBs损伤和细胞凋亡。2、低浓度NaAsO2通过ROS引起HELF和HaCaT细胞p53表达明显升高。3、低浓度NaAsO2可以拮抗MMS所致DSBs损伤。4、ROS和p53在低浓度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs损伤中发挥了重要作用。