随着核技术在军事、工业、医疗等相关领域的广泛应用,核恐怖袭击、突发核电站泄漏、工业及医疗因使用或保管不当引发的核辐射事故等发生的风险日益加剧。机体在短时间内接受大剂量电离辐射照射可引发急性放射病,分为骨髓型、肠型和脑型。小肠对电离辐射高度敏感,较高剂量的全身照射或腹腔、盆腔肿瘤的临床放射治疗可引发不同程度的放射性肠损伤（Radiation induced intestinal injure,RIII）,目前其损伤机制尚未阐明,缺少有效的诊断及防治措施,亟需进一步探究其发病机制,寻找更为有效的放射性肠损伤敏感生物标志物和防治靶点。单细胞转录组测序技术是在单个细胞水平上对转录组进行分析的技术,能够获取单个细胞转录组的精确表达量及精确序列,从而可以解析细胞的异质性,鉴定复杂组织中的不同细胞亚型及特征。目的:利用10x单细胞转录组测序技术对放射损伤及修复进程中不同阶段的空肠组织进行测序,探索不同细胞亚群在放射性肠损伤与修复中的变化规律,发现与急性放射性肠损伤相关的细胞亚群,发掘损伤评估和防治新靶点。材料与方法:1.小鼠腹部照射模型的建立:C57BL/6J小鼠110只进行全腹部单次照射,剂量15Gy,分别于照射后1、3、7、14天取材进行肠重量称重、病理学观察、TUNEL、免疫组化检测等。观察指标及方法包括一般状态、肠重量、病理学观察及绒毛长度、隐窝深度定量分析、细胞凋亡、细胞增殖。2.取空肠10cm制备单细胞悬液,并进行10×单细胞转录组测序。3.单细胞转录组测序和数据分析:3.1细胞聚类分析及亚群鉴定:利用Wilcoxon秩和检验,分析t-SNE图谱中各群细胞转录组表达特征之间的差异,根据特异基因的表达鉴定细胞亚群;3.2小肠细胞放射敏感性及机制研究:通过对比照射后1天组与对照组,各亚群细胞数量变化规律、信号通路变化,解析小肠细胞放射敏感性,遴选与放射敏感性相关通路及基因;3.3亚群细胞数量变化规律分析:对各群细胞数量在照射前后不同阶段的变化规律进行分析,遴选在照射不同阶段特异性变化的亚群,寻找与放射性肠损伤、修复、炎性反应相关的关键亚群;3.4标志性分子的筛选:根据关键干细胞亚群、巨噬细胞亚群的表达特征,遴选在该群特异性表达的基因作为候选标志性分子;3.5上皮细胞亚群空间分布分析:根据小肠隐窝-绒毛不同位置上皮细胞相关标志物表达情况进行计算分析,将上皮细胞亚群按照空间位置进行重构。3.6巨噬细胞和内皮细胞相互作用分析:采用配体-受体（ligand-receptor,L-R）交互作用分析与信号通路分析对巨噬细胞和上皮细胞在RIII炎性反应中的相互作用进行解析。3.7信号通路分析:分析巨噬细胞、上皮细胞在特定生物学状态或过程的标志性信号通路基因集的表达情况,以检测每个亚群细胞不同信号通路的活性。4.单细胞转录组测序结果的验证及解析:4.1巨噬细胞亚群功能解析。根据选取的候选标志分子,采用流式细胞分选,验证巨噬细胞亚群变化情况;采用放射免疫法检测不同巨噬细胞亚群细胞因子表达分泌水平,探索巨噬细胞亚群在照射损伤、修复中的作用。4.2对放射敏感性相关基因Arl6ip1的功能进行验证,根据基因序列,选择不同位点构建Arl6ip1基因的3条si RNA,以慢病毒为载体,在小肠上皮细胞系中敲除相关基因,观察照射前后细胞DNA损伤和增殖变化情况;4.3 CD3+T细胞数量变化规律分析。采用CD3免疫组化染色,验证T细胞亚群在照射前后数量变化情况。结果:1.小鼠RIII表型特征:小鼠14天内死亡率为20%;照射后1天,绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、单位长度内隐窝个数均明显下降,空肠隐窝凋亡细胞数显著上升,部分隐窝出现空化,细胞增殖显著下降;照射后3天绒毛高度、隐窝深度、单位长度内隐窝个数较照射后1天持续下降,隐窝凋亡细胞减少,增殖恢复,可见炎性细胞浸润,空肠内促炎性细胞因子（TNFα、Il1、Il6）含量显著上升,抑炎性细胞因子（Il10）含量显著下降;照射后7-14天,隐窝细胞增殖活跃,小肠绒毛-隐窝结构逐步恢复。2单细胞转录组测序分析结果:2.1单细胞转录组测序技术全景刻画小鼠空肠组织细胞。总测序细胞数为82472个,通过质量控制过滤后,保留分析22,680个细胞和19,588个基因,共鉴定出11大类54个细胞亚群,其中包括5个干细胞亚群、16个上皮细胞亚群、10个T细胞亚群、5个髓细胞亚群;2.2空肠组织不同细胞亚群放射敏感性存在差异:同种细胞不同亚群的放射敏感性存在较大差异。干细胞亚群中,cluster4、cluster9对放射高度敏感,而cluster35在照射后1天比例增加;免疫细胞中,髓细胞、T细胞、B细胞大部分亚群对放射高度敏感,内皮细胞、基质细胞及大部分上皮细胞对放射不敏感;分析照射后第1天存活细胞中明显上调或下调的信号通路,发现在不同细胞类型的存活细胞中,PI3K/AKT/m TOR信号传导通路,MYC信号传导通路,TGF-β信号传导通路以及细胞周期相关通路均持续下调,而Kras信号通路激活后下调的基因在存活细胞中表达增加。将干细胞、肠上皮细胞、髓样细胞和T细胞与对照组细胞比较,发现67种基因（Fabp1、Arl6ip1、Ckmt1、Ghrl、Hspa1b、Ccng1等）在多种存活细胞类型中的表达出现上调,功能注释显示,上调的基因包括已知与凋亡过程的负调控有关的几种基因;2.3不同类型细胞比例分布存在较大差异。所有11大类小肠细胞中,T细胞比例最高,占比26.69%,上皮细胞占比22.83%,髓细胞占比12.96%,干细胞占比10.68%。不同细胞类型在照射前后不同阶段的比例变化同样存在很大差异。2.4巨噬细胞亚群数量变化情况。巨噬细胞亚群按照功能分为促炎性巨噬细胞和定居巨噬细胞,促炎性巨噬细胞在照射后3天特异性富集,定居巨噬细胞在照射后7天特异性富集。2.5上皮细胞空间分布分析对各亚群细胞空间位置重构。通过基因表达特征计算每个上皮细胞在绒毛上的位置,对各亚群细胞进行空间位置重构,解析上皮细胞各亚群细胞照射前后变化规律。2.6巨噬细胞和内皮细胞之间的相互作用可促进RIII的炎症反应。在照射后第3天,内皮细胞通过高表达粘附分子Icam1、Icam2,与促炎性巨噬细胞内高表达的整合素Itgal、Itgax等产生相互作用,在促炎性巨噬细胞的招募过程中发挥作用。此外,内皮细胞也能够通过Ccl2、Cxcl12等趋化因子对促炎性巨噬细胞进行招募。反之,促炎性巨噬细胞能够通过高表达血管内皮生长因子Vegfa,与内皮细胞高表达的Nrp1、Nrp2、Kdr、Flt1等受体因子产生交互作用。信号通路分析显示,与对照组相比,放射后第3天肠道内皮细胞在炎症反应、NF-κB介导的TNFα信号通路、KRAS信号通路、EMT过程上表现出显著上调。2.7巨噬细胞、上皮细胞信号通路分析。对巨噬细胞不同亚群信号通路分析显示,Ly6c+单核细胞在炎性反应相关通路中活性较高,提示该亚群细胞处于炎症激活状态,与机体炎症反应相关。促炎性巨噬细胞中,Kras信号通路激活后下调的基因表达增加。对上皮细胞不同亚群信号通路分析显示,未成熟上皮细胞亚群在细胞增殖、凋亡相关通路高表达,提示未成熟上皮细胞存在一定增殖活性;而成熟上皮细胞亚群在炎性反应相关通路高表达,提示成熟上皮细胞参与机体炎性反应。3单细胞转录组测序结果验证结果:3.1巨噬细胞变化规律及作用。巨噬细胞及促炎性巨噬细胞均在照射后3天显著增多;促炎性巨噬细胞分泌较高水平的促炎性细胞因子:TNFα、Il1、Il6;定居巨噬细胞分泌较高水平的抑炎性细胞因子Il10。3.2敲低Arl6ip1加重电离辐射所致小肠上皮细胞DNA损伤。与对照组相比,腹部照射后第3天,小鼠空肠组织中Arl6ip1表达显著降低,照射后第1天、7天、14天,Arl6ip1表达无显著差异;Arl6ip1-si RNA-565序列（GGCTTGGGTGGGACAGCAAGT）有效敲低细胞中Arl6ip1的表达水平,敲低Arl6ip1的表达后,能够促进照射后细胞DNA损伤,抑制细胞增殖。阴性对照慢病毒对IEC-6细胞活力、DNA损伤没有影响。3.3 CD3+T细胞数量变化情况。CD3+T细胞数量在照射后1天显著下降,照射后3天恢复,照射后7天最多。结论:1.基于单细胞转录组测序技术,构建了放射性肠损伤及修复过程中全景动态细胞图谱。2.小肠同类细胞不同亚群对电离辐射的敏感性存在较大差异。Arl6ip1等基因调控细胞放射敏感性。3.在RIII及其修复早期,肠道内皮细胞与促炎性巨噬细胞之间能够通过特定的L-R细胞因子作用对彼此产生双向的招募或促进作用。内皮细胞中炎症反应相关信号通路的激活可导致内皮细胞对促炎性巨噬细胞招募作用的增强。4.在RIII中,促炎性巨噬细胞（CD45+F4/80+CD11c+CD14+）分泌较高水平的促炎性细胞因子,在照射后炎症期特异性富集,促进肠损伤。