背景及目的:近年来,在社会经济快速发展的社会背景下,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)已成为全球性威胁公众健康的一种常见疾病。在我国,CKD具有庞大的人群及高患病率。而肾小管间质纤维化(renal tubular interstitial fibrosis,TIF)是多数慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭共同的病变过程及最后通路。TIF是以正常的肾间质和肾小管结构消失而大量的细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)聚集及肌成纤维细胞大量增殖为特征的病理过程,它几乎存在于所有肾脏疾病中并决定肾脏损伤程度及预后。对于TIF所致的终末期肾脏病,病人只能依靠透析治疗来维持生命,或接受肾移植治疗,对个人、家庭及整个社会均造成沉重的经济负担。因此,如何能延缓甚至逆转TIF,探索其发病机制并寻找干预靶点来延缓肾功能进展、改善CKD患者的预后已成为需要迫切解决的公共问题。但是,到目前为止,TIF的发病机制尚未阐明,TIF的确切来源目前仍不清楚,发生TIF时肾脏的损伤是否能修复甚至逆转及怎样逆转尚存在争议,针对其治疗亦缺乏有效手段。大量的研究表明,肾小管在受损时具有修复功能,但肾脏的小管间质纤维化能否逆转修复一直不清楚。有关啮齿类动物的单侧输尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction,UUO)已被成功构建并广泛应用于肾间质纤维化等肾损伤的研究中。有关研究表明,解除单侧输尿管梗阻也就是将梗阻再通后(relief of unilateral ureteral obstruction,R-UUO),肾实质具有再生、修复倾向。目前为止,大多数研究均集中在UUO模型,少量关于R-UUO的研究也是有关于鼠类的研究。既往有关肾小管的损伤修复所利用鼠类的研究,肾脏大小与人相差较大,且损伤前后不同个体之间差异也很大。为此,本研究试图构建单侧输尿管梗阻-再通的大动物模型,充分模拟人类梗阻性肾病的疾病状态,通过肾活检的方法探讨同一动物、同一肾脏不同时间节点损伤前后的变化,旨在明确肾小管间质纤维化能否修复以及修复的时间节点。材料与方法:首先,我们通过反复实验论证,成功构建了大动物猪的单侧输尿管梗阻-再通模型:采用3月龄大小的雌性广西巴马小型猪,体重约8-10公斤。术前准备,术中给予联合麻醉并进行无菌手术操作造模。造模时单侧输尿管梗阻采用聚乙烯片包绕、手术线结扎法,解除梗阻时,遵循同样操作并去除包绕的聚乙烯片和手术线。实验猪经过单侧输尿管梗阻(UUO)后,肾脏大体结构呈现显著变化。与正常肾脏比较,梗阻侧肾脏体积增大、表面粗糙,同时出现了肾积水和肾盂扩张,血运减少。此外,梗阻上端输尿管迂曲、增粗、血运减少,而再通后的输尿管变直、变细,基本恢复至正常输尿管形态。此模型在梗阻时肾脏和输尿管的大体结构出现了显著变化,而再通后显著恢复,造模成功。其次,在本研究的前期工作中,为了初步摸索猪的单侧输尿管梗阻-再通后其肾损伤可能修复的时间节点,我们进行了预实验并将实验用小型猪分为梗阻2周组及梗阻3周组,通过肾活检组织病理染色法评估肾损伤程度。结果表明:实验猪在梗阻2周时,肾脏间质出现了较为严重的纤维化损伤。而梗阻3周时,肾脏出现了更为严重的大量不可逆的纤维化改变。因此,为了能观察到损伤后的可逆性修复,我们将梗阻时间点选择为5天,7天和10天。此外,梗阻10天的时间段较长,肾脏需要更长时间的修复,因此观察梗阻10天再通后的时间点也适当延长至56天。接下来,为了进一步研究实验猪梗阻-再通后损伤是否能够修复和具体能够修复的时间节点,我们又将实验用小型猪分为三组:每组6头猪。一组:梗阻5天(UUO5d)、再通7天、再通14天、再通21天;二组:梗阻7天(UUO7d)、再通7天、再通14天、再通21天;三组:梗阻10天(UUO10d)、再通14天、再通28天、再通56天。每组5个时间点,取梗阻前0天作为正常对照。分别从功能、组织结构和蛋白分子水平三个层面评估不同时间点肾脏损伤-修复程度:留取前腔静脉及梗阻侧和对侧分肾静脉血,检测其血清肌酐水平来评估肾功能;通过开放式肾活检法留取肾组织,半定量评分法评估肾脏病理损伤-修复情况;免疫印迹法测定肾小管间质纤维化标志物α-SMA、vimentin和上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平。结果:梗阻5天、7天和10天时,与梗阻前相比,血清肌酐水平显著升高,肾组织出现不同程度的病理损伤,肾脏α-SMA、vimentin表达显著增高而E-cadherin表达显著下降,差异均有统计学意义(p<0.05)。梗阻5天和7天再通后,随着再通时间的延长,血清肌酐水平较梗阻时平稳下降,肾组织损伤在组织病理学上表现为完全恢复和部分恢复,α-SMA、vimentin表达下调而E-cadherin表达上调(p<0.05)。而梗阻10天再通后血肌酐在一段时间的降低后又反弹性的增高,肾组织损伤在组织病理学染色上未能体现出损伤恢复而转为慢性病变,尽管E-cadherin较梗阻时有所增高,但E-cadherin的表达并没有明显降低。说明梗阻5天、7天再通的一定时间段内肾脏损伤修复较好,而梗阻10天再通56天后肾损伤并未完全修复反而转为慢性病变。再次,本研究初步探讨了肾脏小管间质纤维化损伤修复的相关机制:根据梗阻再通前后肾小管上皮细胞的标志物E-cadherin和间充质细胞的标志物α-SMA、vimentin的表达水平变化,我们初步推测,猪的单侧输尿管梗阻-再通、肾小管间质纤维化损伤修复可能伴有上皮细胞-间充质转分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及其逆转的发生,即EMT及其逆转可能参与到肾脏间质纤维化的损伤及修复再生中。结论:本研究成功构建了大动物猪的单侧输尿管梗阻-再通模型,在同一只猪、同一个肾脏观察到了不同时间点肾间质纤维化的损伤程度并发现了损伤后修复的时间节点,并进一步通过此结果推测:早期的肾小管间质纤维化在病因去除后可能能够逆转修复,但长期损伤所致的慢性肾小管间质纤维化较难恢复。另外,通过初步探讨肾脏损伤修复的机制,我们推测,肾间质纤维化的损伤修复可能与EMT及其逆转相关,这为TIF的机制研究提供了新的理论依据。总之,本研究为肾小管间质纤维化的机制研究提供了新的思路和方法,为体内研究肾脏损伤修复及进行药物干预来评估药理功效提供了较好的实验平台,可能为防止肾间质纤维化的进展提供新的治疗策略。