研究背景子宫体癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其中97%来源于子宫内膜腺体。世界各地子宫内膜癌(EC)的发病率差异较大,在欧美等发达国家,其发生率位居首位。在我国,其发生率仅次于宫颈癌。据统计,随着人口老龄化和人类寿命的延长,子宫内膜癌的发病率有逐年上升的趋势。目前,对于子宫内膜癌的研究已经形成一个公认的“二元论”的模式,即将子宫内膜癌分为I型和Il型。I型子宫内膜癌发生是在无孕激素拮抗的雌激素长期作用下,多数发生在子宫内膜增生症的基础上,中等分化,预后好。II型与雌激素无明确关系,占10%,多数有子宫内膜萎缩,复发及转移率高,分化差,预后不良。研究认为,肥胖、高血压、糖尿病、不孕或不育、绝经延迟等是EC的高危因素。它的发生、发展是多种因素参与、多步骤的复杂过程,多数学者认为是下列因素相互作用的结果：激素的调节,基因突变,粘附分子,细胞凋亡,基质金属蛋白酶与其抑制子的平衡关系。该疾病多见于50岁以上绝经期及绝经后的中老年妇女,最先表现为不规则阴道流血,因此,病人往往在早期阶段(FIGO Ⅰ期)已被确诊,I期患者5年生存率>80%,但有一部分患者仍然有复发或转移的高风险。复发和转移是子宫内膜癌患者治疗失败和死亡的主要原因。因此,研究子宫内膜癌生物学行为,寻找敏感性相关性生物学标志物有助于临床工作。淋巴转移及直接浸润为EC的主要转移途径,尤其当癌肿浸润深肌层或分化不良等,具有高侵袭性时更易较早发生局部及盆腔淋巴转移,直接影响治疗效果。恶性肿瘤的淋巴转移首先发生在肿瘤组织的局部、周边,肿瘤组织分泌组织因子促进局部微淋巴管增生,并降解细胞外基质成分,促进肿瘤细胞浸润并经由淋巴循环扩散、转移。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)家族是一类结构相类似的蛋白酶,它能降解细胞外基质以及基底膜。目前发现基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)几乎在所有的肿瘤组织中均有过表达及高活性,是肿瘤细胞侵袭和转移的关键因素。其中基质金属蛋白酶9(MMP-9)被研究的最广泛,它是MMPs家族的主要成员之一,在血管和基底膜部位降解IV型胶原和纤维连接蛋白。机体正常的生理过程,如子宫内膜生理周期的变化,胚胎发育、组织塑性、再生等都依赖于MMP-9调控。基质金属蛋白酶-9以无活性的酶原形式分泌至胞外,其最主要的激活系统是纤溶酶原激活物。活化的MMPs还可以引起MMPs之间较为复杂的瀑布式的级联激活过程。激活MMP-9最后导致基质降解。它的激活被认为是启动了肿瘤细胞的转移。目的多项研究证实,在子宫内膜癌组织中有MMPs(MMP-l、2、7、8、9、MTI-MMP)表达的改变。其中有研究者采用夹心免疫法,酶谱法,ELISA,原位杂交等不同的实验方法,均检测出子宫内膜癌组织中MMP-9的表达及活性比对照组高。推测内膜癌组织中MMP-9的过表达,它可以通过降解细胞外基质、增加细胞粘附能力、促进新生血管生成来促进肿瘤细胞的生长。但对于MMP-9的表达与内膜癌患者临床病理参数之间的关系,以及它的预后价值存在一些争议。Karahan N等发现MMP-9的高表达有统计学意义,与血管和淋巴管入侵相关。Lopata等也证实子宫内膜癌宫腔冲洗液的MMP-9表达是升高,有淋巴结转移的高于无转移者。Di Nezza等运用用免疫组织化学的方法检测内膜癌组织中MMP-9蛋白的表达情况,结果显示MMP-9蛋白的表达水平明显高于非肿瘤组织,且与肌层浸入和血管或淋巴浸润有密切相关。Aglund等研究也指出MMP-9的蛋白表达与肿瘤病理级别及临床分期有关系。相反,Honkavuori等的研究表明,内膜癌组织中MMP-9的蛋白表达与患者的临床病理参数无关系。因此,本研究目的是应用免疫组化的方法检测MMP-9在子宫内膜癌患者中的表达情况,并分析它与临床病理参数之间的关系,以及在癌症患者中的预后价值,为子宫内膜癌的发病机制及其治疗提供有益的线索。方法1、标本的收集收集广州医学院第三附属医院2002-2007年间住院患者的内膜癌石蜡标本128例为实验组,同时收集30例正常子宫内膜及30例不典型增生内膜组织为对照组。子宫内膜癌患者在手术前均未接受化疗或放疗。患者平均年龄51.6岁(30-85岁)。临床随访时间是5至102月。所有标本均经病理检查确诊,术后根据FIGO2009对患者进行手术-病理分期。2、免疫组化获取128例子宫内膜癌、30例子宫内膜不典型增生和30例正常子宫内膜组织的石蜡标本,3um连续切片。石蜡切片二甲苯(100%)脱蜡、梯度酒精脱水(100%,90%,80%,70%)后,切片浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液(PH6.0),微波煮沸(100℃)2min进行抗原修复,用含3%H202的过氧化物酶阻断剂灭活内源性过氧化物酶,羊血清封闭后不洗,滴加1：100稀释的一抗(Sc6840,Santa,MA,USA),4℃孵育过夜；PBS漂洗后,生物素标记的兔抗羊二抗在室温下孵育10min随后用链酶菌抗生物素-过氧物酶孵育10分,DAB显色,苏木素复染,1%盐酸2乙醇分化20s,脱水、二甲苯透明后,中性树胶封片,显微镜下观察。3、结果判断由两位病理专家对所有免疫组化染色的切片进行双盲分析,参考R.Masunaga, Z. Liu等评分：着色细胞比例在10%以下为0分,10%～25%为1分,26%-50%为2分,50%～75%为3分,大于76%为4分；着色程度,浅黄色1分,橘黄色2分,棕褐色3分。根据两者之和判断等级：0-5分为低表达,≥6分为高表达。4、统计分析所有数据均用SPSS13.0统计软件处理,分析MMP-9的表达水平与临床病理参数之间的关系采用卡方检验,单因素生存分析用Kaplan-Meier法,并行Log-Rank检验；多因素分析采用Cox回归模型,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1、应用免疫组织化学染色法检测128例子宫内膜癌石蜡切片,30例不典型增生内膜及30例正常子宫内膜石蜡切片的MMP-9蛋白在细胞中的表达位置及过表达率。MMP-9在EC组织及非肿瘤组织中均表达于胞浆,在子宫内膜癌,不典型增生内膜及正常子宫内膜的高表达率分别为42.2%,26.7%,16.7%,差别有显著性(χ2=8.154,P=0.017),子宫内膜癌组织中MMP-9的表达显著高于非肿瘤组织(χ2=7.500,P=0.006)。2、分析MMP-9表达水平与子宫内膜癌患者临床病理参数的关系。MMP-9过表达在年龄、月经状态、FIGO分期以及肌层浸润的深度中无统计学意义,在淋巴结转移的状态及病理分级中差异有显著意义(χ2值分别为4.076,6.276,P值分别为0.044,0.043)。3、我们用Kaplan-Meier法及log-rank检验进行生存率的估计与生存曲线的分析,发现MMP-9的阳性表达与患者生存率无相关。Cox比例风险回归模型分析可能影响EC患者预后的各个因素,包括患者的年龄,肿瘤家族史,文化程度,医疗保险,职业,月经状态,FIGO分期,病理分级,肌层浸润深度,淋巴结转移状态,合并症(高血压、糖尿病),病理类型,MMP-9的表达水平。病理分级,淋巴结转移的状态和肌层浸润的深度对EC患者的预后有重大意义,而MMP-9对EC患者预后的预测尚无独立意义。结论通过测定MMP-9在EC组织和非肿瘤组织中的表达,发现MMP-9在EC组织中表达明显升高,提示MMP-9可能在促进EC发生和发展中起重要作用。在病理分化差的EC组织中MMP-9的表达较分化较好的EC组织中明显升高,有转移的EC组织中MMP-9表达较无转移的EC组织中升高,可能与它破坏靠近EC细胞表面的细胞外基质和基底膜有关,进而促进EC的侵袭与转移。MMP-9与EC患者的生存率无关,Cox多因素生存分析结果：病理分级,淋巴结转移的状态及肌层浸润的深度对判断患者的预后有重大意义,而MMP-9不是子宫内膜癌的独立预后因素。由于样本量较少以及EC本身是一种预后较好的肿瘤,需进一步的研究证实MMP-9在EC中的作用以及它对EC患者的预后价值,我们可以扩大样本量或在子宫内膜癌细胞系中导入MMP-9基因,观察细胞增殖,迁移,侵袭和转移的能力或者裸鼠体内植入肿瘤细胞,观察其肿瘤发生率及生存时间。