研究目的与背景近年来,结肠癌的发病率与死亡率不断升高,已成为导致我国癌症病人死亡的主要原因之一。结肠癌患者的死亡多是由于发生了肝转移,约有60%以上的晚期结肠癌病人均伴有不同程度的肝转移。结肠癌的发病机理十分复杂,干细胞理论认为肿瘤组织中具有干细胞样特性的细胞才是导致结肠癌发生的原因。不同于一般的肿瘤细胞,肿瘤干细胞(cancer stemcell,CSC)可以在增殖过程中保持自我更新,同时还具有较强免疫逃逸能力;虽然CSC数目很少,但可引起肿瘤的发生或者转移;而且CSC对传统的治疗手段有着相当高的抗性,容易导致肿瘤复发。因此,靶向CSC被认为是新的、有效的治疗包括结肠癌在内的大多数肿瘤的重要手段之一。肿瘤的发生除了伴有重要功能基因的突变以外,还与一些特定基因的表观遗传学修饰有关系。表观遗传学修饰中甲基化修饰方面的报道居多,且机制比较明确。异常的DNA甲基化,会引起一些重要的基因表达发生变化,不断累积后会使细胞功能发生改变,进而导致细胞分化或增殖异常,致使各类疾病甚至是肿瘤发生。有趣的是,DNA甲基化是一种特殊的、可逆的生化修饰方式,通过DNA甲基转移酶(DNMT)进行调控。研究表明,DNMT的异常表达会导致肿瘤的发生或恶化。最近的研究发现,DNMT抑制剂可通过抑制肿瘤细胞内抑癌基因的DNA甲基化使其重新表达,从而有效抑制肿瘤细胞的生长。此外,DNMT抑制剂还能靶向肿瘤内的CSC从而降低肿瘤细胞的成瘤能力。因此,抑制DNMT可能是治疗结肠癌的有效策略。然而,关于DNMT在结肠癌细胞干性维持和肝转移中的作用与机制尚不清楚。在本文的研究中,我们检测了 DNMT抑制剂对结肠癌干性相关特征与肝转移瘤生长的影响,并全面探讨了其作用机制。研究方法与结果第一部分:首先,我们通过DNMT活性检测、生长计数、克隆形成、成球实验、皮下成瘤实验和transwell侵袭实验等检测了 DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-AzaDC)对结肠癌HCT116和SW620细胞生长与干性特征的影响;同时,我们通过流式细胞术和Westenblot(WB)的方法检测了 5-AzaDC对结肠癌细胞CD44和CD133表达的影响,从而研究DNMT在结肠癌细胞HCT116和SW620干性维持中的作用;采用HCT116细胞裸鼠肝转移瘤模型以及HE和IHC染色等方法检测了结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,从而对体外相关结果进行验证。第二部分:我们采用了免疫荧光、WB、Q-PCR、MSP及IHC等方法,结合TCGA数据库研究了 Wnt通路抑制基因甲基化在结肠癌细胞干性维持中的相关分子机制进行的探索;同时,通过基因过表达的方法研究了 Wnt/β-catenin通路抑制基因SFRP1在HCT116细胞干性维持中的作用。结果表明:SFRP1在结肠癌临床样本和细胞株中的表达都非常低,且其mRNA的表达受甲基化的调控,而SFRP1去甲基化后可降低β-catenin的蛋白水平并抑制其入核,从而抑制Wnt通路下游靶基C-myc,CyclinD1与MMP7的转录和表达;IHC结果显示经DNMT抑制剂处理后,肝转移瘤组织细胞内的β-catenin的表达分布发生了明显的变化,β-catenin在核内和胞浆内的表达显著降低;SFRP1过表达后抑制了 β-catenin的表达并降低了 HCT116细胞的自我更新能力,使CD44阳性细胞比例显著减少。结论我们的研究结果表明,DNMT可通过甲基化特异性抑制Wnt通路抑制基因SFRP1的表达,在结肠癌细胞的干性维持中发挥作用,DNMT抑制剂可以有效抑制结肠癌细胞的干性和肝转瘤的生长。因此,抑制DNMT有可能成新的对抗结肠癌的重要方法和手段之一。