论文部分内容阅读
柠檬酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等行业。目前,黑曲霉是柠檬酸发酵生产的主要菌株,但是黑曲霉自身糖化酶的表达能力较低、能荷水平较高,导致发酵过程的残糖浓度较高、糖代谢效率低等问题,严重限制了柠檬酸行业的发展。本论文从生产实践角度出发,运用基因工程手段对黑曲霉进行遗传改造并通过调控黑曲霉胞内能量代谢的方式改善发酵状况提高柠檬酸产量。具体研究内容如下:运用RT-PCR技术对黑曲霉TNA 101 AagdA RNA进行反转录合成glaA-cDNA,并将其与NCBI数据库上公布的黑曲霉CBS 513.88的glaA-cDNA基因序列(GenBank:XM 001390493)和氨基酸序列进行了比对(GenBank:XM 001390493)。结果表明,glaA-cDNA序列的相似性为99.90%,氨基酸序列的相似性为99.84%。通过重叠PCR技术构建了含有过表达元件的质粒p55,并将质粒p55电转农杆菌。通过农杆菌侵染黑曲霉TNA 101ΔagdA的方法成功获得三株糖化酶过表达菌株TNA OG 1、TNA OG 17和TNA OG 31。15代的传代实验证明三株糖化酶过表达菌株均具有较好的遗传稳定性。TNAOG 1和TNA 101ΔagdA中α-葡萄糖转苷酶与糖化酶活力的测定结果表明,两菌株的α-葡萄糖转苷酶活力相当。而TNA OG 1最高糖化酶活力比TNA 101 ΔagdA提高34.48%。通过实时荧光相对定量PCR对TNA OG 1与TNA 101△agdA的glaA基因表达差异进行研究,结果表明28 h菌株TNA OG 1中glaA基因的表达量是TNA 101ΔagdA的1.43倍。柠檬酸发酵实验的结果表明,相比于菌株TNA 101ΔagdA,TNA OG 1发酵时残还原糖含量降低了 36.67%,糖酸转化率提高了 2.72%,柠檬酸产量提高了 8.91%。在30 L与500吨发酵罐上的柠檬酸发酵试验表明,TNA OG 1的平均产酸浓度为173.72 g/L,平均糖酸转化率达到101.51%。这说明提高糖化酶活力有利于黑曲霉对底物的利用,降低残糖含量及生产成本,提高糖酸转化率,进而提高柠檬酸产量。通过测定黑曲霉TNA OG 1与标准菌株ATCC 1015胞内ATP、NADH含量以及NADH/NAD+的变化,发现黑曲霉TNA OG 1胞内ATP、NADH与NADH/NAD+均低于ATCC 1015。在柠檬酸发酵24 h,添加0.2 mg/L氧化磷酸化抑制剂抗霉素A或者0.1 mg/L氧化磷酸化解耦联剂DNP可以有效降低黑曲霉TNA OG 1胞内ATP含量,加快NADH的氧化速率,并使柠檬酸积累分别提高14.97%、8.93%。这说明胞内ATP与NADH浓度对柠檬酸的积累有重要影响,适当降低黑曲霉胞内ATP含量,加快NADH的氧化有利于提高柠檬酸的产量。