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近年来肿瘤的发病率和死亡率呈上升趋势，复发和转移是恶性肿瘤致死的重要原因。随着肿瘤分子生物学的飞速发展，肿瘤转移的分子机制成为最热门的研究领域之一，但迄今对转移机制仍缺乏明确详尽的解释。目前已认识到，肿瘤的转移是一系列持续选择的过程，包括：肿瘤细胞对细胞外基质(ECM)的识别、对ECM的降解、细胞迁移、在脉管内转运播散以及转移器官的选择。其中恶性细胞与ECM的相互作用被认为是恶性肿瘤细胞转移过程中最关键的分子事件之一。肿瘤细胞必须识别和降解其周围的ECM才能发生侵润和转移。因此研究ECM降解酶对认识和控制肿瘤转移具有重要的意义。与肿瘤细胞的侵润有关的一种ECM降解酶家族被称为丝氨酸蛋白酶家族包括(尿激酶型(uPA)，弹性蛋白酶(elastase)，组织蛋白酶G(cathepsin G))等。最近又发现一个丝氨酸蛋白酶家族的新成员--Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族(type Ⅱ transmenbrance serine proteases，TTSPs)，其家族成员广泛分布于各种组织细胞的膜上，参与降解ECM、水解活化细胞膜蛋白、与细胞骨架相互作用及信号传导等作用，而且可能还与肿瘤细胞的侵润转移有关。SNC19／ST14／MT-SP1／Matriptase基因被认为是TTSPs基因家族的一个成员。 SNC19基因是1993年浙江大学肿瘤研究所郑树教授等应用减式杂交技术从正常大肠cDNA文库中筛选到的一个大肠癌新相关基因，1995年被Genbank作为新基因登录，1998年国际基因命名委员会将SNC19命名为ST14。随后，从不同物种的组织细胞、乳汁和肿瘤细胞系中，得到多个SNC19／ST14基因的同源产物，如Matriptase，膜型丝氨酸蛋白酶(membrance-type serine proteinase-1，MT-SP1)，Epithin，XMT-SP1，Matriptase-2和M-matriptase-2。SNC19／ST14蛋白现被命名为ST14／MT-SP1／Matriptase／TADG-15；EC 3.4.21。蛋白酶活化受体—2(proteinase-activated receptor 2，PAR2)、浙偏工，冤学仁件d匕月丸亡比论文单链尿激酶型纤维酶原激活剂(Urokinase一type plasminogen aetivator，u队)的前体一sc一uPA和肝细胞生长因子/扩散因子(Hepatocyte growth几etor/scatterfaetor，HGF/SF)的前体一pro一HGF/SF被证实是MT-Spl彻atriptase的作用底物「8，。u队与ECM的降解及肿瘤细胞的侵润密切相关，而HGF/SF能刺激肿瘤细胞相互作用、基质粘附、迁移、侵润和血管生成‘’‘，。SNC19/ST14/MT一SPI有丝氨酸蛋白酶的结构域，具有胰蛋白酶样活性，可直接降解ECMls，。另外，我所用原位杂交方法发现淋巴结转移组大肠癌旁粘膜SNC19表达阳性率(64.7%)高于无淋巴结转移组(巧.4%) (P<0.05)。国外学者研究发现MatriPtase/MT一SPI还高表达于前列腺、乳腺癌、子宫颈癌组织中”5，’6.”，;本所通过免疫共沉淀方法及Q一TOF MS/MS测序发现，SNC 19/ST14蛋白与细胞骨架蛋白F一actin能相互作用。这些研究结果显示SNC 19/S T14/MT-SPI/MaPtriPtase可能与肿瘤的转移相关，可能参与了肿瘤侵润和转移过程。但无直接的证据表明SNC 19/S T14是促进还是抑制转移以及其影响转移的具体机制。为了进一步研究SNC 19/sT14/MT-Spl/Maptriptase在肿瘤侵润和转移过程中所起的作用，本论文作了以下研究: 1、建立稳定表达况NCI刃夕T14全长阅读开放窗(ORF)的大肠癌细胞系一RKO一SNC19/ST14 构建况NC了隽害T14全长口丑F的真核表达重组质粒，并用阳离子脂质体转染入不表达况NCI洲兮T14基因的结肠癌细胞系RKO细胞中，转染细胞在选择培养液中克隆化培养，筛选稳定表达况NCZ州夕T14基因的细胞，得到一株群体细胞RKO一SNC19/ST14一1和一株单克隆细胞RKO一SNC19/ST14一2;RT-PCR和Real一TirnePCR可检测到两株细胞都有及NCI勿污T14基因的表达;Western Blot检测到两株细胞都表达一约86.5KD的况NC了久6.TI4蛋白;免疫组化显示况N亡Z刃夕TI4蛋白主要表达于RKO一SNC19/ST14细胞浆和细胞膜。RKO细胞表达况NCI火夕T14后，丝氨酸蛋白酶的活性明显升高。 2、采用Mieroarray和Real一Time PeR技术，检测RKo细胞表达￡Nc了孵T14基因后，肿瘤转移相关基因表达的变化 5人乞了马书7’14基因在大肠癌RKO细胞中表达后，影响了26个转移相关基因的表达;有巧个基因表达的变化可产生促进肿瘤细胞转移的效应，有n个基因表达变浙三工大学博士.学位论义化可抑制肿瘤细胞转移;其中变化最显著的抑制转移的基因有青元冰~I(增加了约550倍);变化最显著的促进转移的基因有:IG矛’2(增加了约1500倍)，ETSZ(增加了约230倍)，I创材况ETV4(增加了约600倍)，MGA万(增加了约840倍)，而ETSZ柳ETv4是一类较为关键的转录因子，使几打沙乃，M刹”柳弄了dsPin等的表达发生变化而促进肿瘤细胞转移;另外研究发现，在检测基因表达差异时，Real-Time尸C左与几打‘roarray法能够得到基本一致的结果。 3、研究RKO细胞表达左NC了势份T14基因后，其细胞生物学行为的改变 体外试验:用MTT法分别测定细胞的群体倍增时间(To)，与ECM的粘附能力的变化;流式细胞仪测定细胞周期的变化;罗丹明一鬼笔环肤标记细胞的骨架蛋白F