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成纤维细胞生长因子21（FGF21）是近些年来研究比较成熟的代谢调节剂之一,在糖尿病以及肥胖等代谢性疾病治疗的研究中已经展现出它的重要作用,因此,FGF21已经成为治疗代谢性疾病的潜在药物。然而,由于它本身的性质,即:（1）蛋白质激素;（2）体内半衰期很短,使得外源给予FGF21无法满足更加方便而且令其持久的发挥作用的愿望。我们课题组研究发现,运用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）这一食品级细菌作为宿主菌表达人源FGF21,就可以满足方便且在体内持久发挥FGF21作用的愿望。传统细菌经过基因改良后,作为异源蛋白表达宿主时,常常用抗生素抗性基因做为筛选标记,这样就存在很大的生物转基因引起抗生素耐药潜在危机。因此,对食品级细菌做为表达系统的研究就显得尤为重要。材料与方法1.菌株选择乳Lactococcus lactis NZ3900,载体选择PNZ8149（LacF为筛选标记）,Gen Bank查询Human FGF21序列,全基因合成,经过亚克隆,双酶切与载体连接,电转化入LacF基因缺失的菌株NZ3900,Elliker板筛选阳性克隆,菌液PCR,测序鉴定。为检测蛋白在后期动物实验中能否到达血液,构建FGF21序列C端带有6xHis标签的载体,阳性菌株的鉴定方法同上,同时结合Human-FGF21 Elisa Kit检测,共同验证目的蛋白Human-FGF21到达血液。2.得到阳性菌株后,接种到M17 broth中,30度静置培养,OD600:0.40.6时,加诱导剂nisin至终浓度0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml,诱导表达5h后TCA法沉淀蛋白,制作12%SDS-PAGE胶,SDS-PAGE凝胶电泳,银染,检测目的蛋白的有无及量的多少。将蛋白胶银染后,进行质谱分析测定蛋白序列。3.质谱测序成功后的菌株培养后1013CFU于200ul含25ng/ml Nisin灌胃处理DB/DB鼠,MRI体脂扫描,Elisa,RT-PCR,Western-blot,HE组织切片染色等实验检测重组菌株对小鼠的作用。结果1.PNZ8149-FGF21重组载体构建成功,采用电转化的方法,结合最终测序结果,成功得到PNZ8149-FGF21/NZ3900重组菌。2.PNZ8149-FGF21/NZ3900重组菌体外蛋白诱导表达成功,SDS-PAGE凝胶电泳结合后期SDS-PAGE凝胶蛋白银染,分析可知目的蛋白Human FGF21分子量大小25KD处有特异性条带,对该条带进行蛋白质谱测序分析可知含有可信蛋白Human FGF21。且25ng/ml Nisin为最佳诱导剂浓度。3.将重组菌株及其对照组菌株过夜培养后,1013CFU菌体量混悬到200ulPBS体积中且含25ng/ml Nisin处理DB/DB小鼠后,与对照组相比,小鼠整体稳态得以改善,且检测到血液中FGF21浓度有一定程度的增加,后期RT-PCR,Western-blot,HE组织切片染色结果显示小鼠棕色脂肪活性改善明显且脂肪肝症状有所改善。结论成功构建的原核表达体系为食品级,诱导蛋白表达后上清蛋白沉淀,SDS-PAGE凝胶电泳,银染,且在相应大小位置看到特异性条带,蛋白表达成功,质谱结果也显示为目的蛋白;DB/DB小鼠处理后,其整体健康状况有所改善,综合结果表明NZ3900/PNZ8149-FGF21有潜在的药用价值。