尽管乙肝疫苗已普遍接种,乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是一个严重的公共卫生问题。HBV属于嗜肝DNA病毒,进入宿主肝细胞核后形成共价闭合环状DNA (cccDNA),以cccDNA为模板转录生成前基因组RNA(pre-genomic RNA, pg RNA)是HBV复制周期中的关键环节。HBV感染诱导宿主细胞上调甲基转移酶的表达,通过DNA甲基化调控HBV cccDNA的转录活性,为了进一步阐明DNA甲基化抑制病毒转录及复制的具体机制,我们开展了以下三部分研究工作。在第一部分工作中,我们分析了176例基因型A-J的JHBV核苷酸序列中CpG岛(CpG island, CGI)的分布及各型之间的差异。通过MethPrimer软件分析发现HBV基因组有三个CpG岛,存在被DNA甲基化修饰的基础。岛Ⅰ跨HBV S基因起始位点,岛Ⅱ紧邻核心启动子,和增强子Ⅰ、Ⅱ,与X基因启动子重叠,岛Ⅲ包含HBV P基因的起始位点以及S基因启动子sp1。并且作为DNA甲基化作用靶点的CpG双核苷酸在不同基因型HBV序列中的分布存在明显差异,部分基因型HBV岛Ⅰ缺失。基因型C、F、G、H和J基因型以2岛分布为主,A、B、D、E和I基因型以3岛分布为主。基因型B、C、D和H基因型中存在新的CGI。基因型C与基因型B的岛Ⅰ区域的GC含量存在显著差异。在第二部分工作中,我们分析了30例中国慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织中HBV cccDNA 3个CpG岛的甲基化分布情况。所有入选的患者均未接受过任何抗病毒治疗。通过亚硫酸氢盐转化方法处理肝组织中提取到的HBV cccDNA,PCR扩增病毒基因组中的3个CGI,基因测序分析其甲基化程度。本实验的分析结果显示CHB患者肝组织中的HBV cccDNA存在一定程度的甲基化。其中,岛I中CpG双双核苷酸的胞嘧啶极少发生甲基化,只在5例(18.5%)的患者中检测到少数位点发生甲基化。岛Ⅱ的甲基化与血清病毒载量存在良好的线性关系,低病毒复制组(Log10 copies/mL<5)的岛Ⅱ甲基化程度显著高于高复制组(Log10 copies/mL≥5),提示岛Ⅱ的甲基化抑制病毒复制,可能与核心启动子活性受抑有关。年龄也是岛Ⅱ发生甲基化的相关因素,年龄≥40岁患者的岛Ⅱ甲基化程度高于年龄<40岁组。此外,基因型C患者的岛Ⅱ甲基化程度高于基因型B组；HBeAg(-)患者岛Ⅱ甲基化程度高于HBeAg(+)组；肝脏纤维化分期为S3-4患者的岛Ⅱ甲基化程度高于纤维化分期S0-2组。我们的数据还发现,发生在岛Ⅲ的甲基化与血清低HBsAg滴度有关,推测与sp1启动子活性受抑有关。在第三部分工作中,我们对体外研究HBV中单个CpG岛功能的方法进行了探索。目前仅有的HBV DNA甲基化体外研究方法是：采用DNA甲基转移酶体外对3.2kb HBV线性单体进行笼统的修饰后,转染肝癌细胞系HepG2后,用real-time方法检测病毒mRNA的转录水平,该方法明确了体外DNA甲基化抑制HBV病毒RNA的转录。但是,这种方法无法分析单个岛的功能,即不能明确DNA甲基化介导转录抑制的作用靶点。在本实验中,我们通过PCR方法分别扩增CpG岛(PCR产物不含甲基,而质粒有甲基化修饰),在体外对其进行甲基化修饰后,再与其互补DNA片段连接成完整的3.2kb HBV环状单体,体外转染HepG2细胞后,通过Northern blot和Southern blot分别检测乙肝病毒的转录和复制水平,发现岛Ⅱ甲基化的HBV单体的RNA转录水平以及病毒复制显著低于对照组,即岛Ⅱ甲基化参与HBV cccDNA转录活性的调控,与第二部分的实验结果也是一致的。此外,既往的观点认为,乙肝病毒的核心蛋白参与组成胞核内的病毒微染色体,通过改变染色体构象调节cccDNA的转录活性。本实验将核心蛋白正常表达或表达缺失的HBV线性单体转染HepG2细胞,检测发现其HBV RNA转录水平无显著差异,即在核心蛋白缺失的情况下,体外瞬时转染HBV线性单体,HepG2细胞中的cccDNA转录水平没有明显差别。