背景与目的结肠癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,在我国结肠癌的发病率以每年4.2%的速度递增,居于常见肿瘤第四位。联合化疗是晚期结肠癌患者姑息治疗和根治术后辅助治疗的主要手段。氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作为有效地化疗药物无论是单用还是联合随后出现的新的化疗药物如伊立替康(Irinotecanpto)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、卡培他滨(Capecitabine)等,对于进展期结直肠癌的治疗都取得了令人鼓舞的效果,中位生存期在10-14个月。近几年,分子靶向药物的研发和临床使用愈加广泛,抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体如贝伐单抗(Bevacizumab)和抗表皮生长因子受体(EGFR)如西妥昔单抗(Cetuximab,C225)、帕尼单抗(Panitumumab)是目前主要的两类批准用于临床的分子靶向药物,这些靶向药物的应用改善了结肠癌患者的生存质量。C225是人鼠嵌合单克隆抗体,拮抗EGFR结合位点,阻止胞内络氨酸激酶的活化,在我国获批准联合CPT-11作为晚期结直肠癌治疗的二线方案,近几年的临床使用已有部分患者从中受益。虽然细胞毒性药物及分子靶向药物为部分结肠癌患者带来福音,但很多结肠癌患者在经历了数次化疗后产生多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)而影响疗效,化疗后复发也造成化疗失败,这些都是最终导致患者死亡的原因,截至目前转移性结肠癌患者的5年生存率仍不超过10%。这些经药物处理后残存的癌细胞其生物学特性是否发生改变,其对于肿瘤的生长以及复发转移有何影响,这是临床有待解决的关键问题。体内外研究发现MDR的分子机制很复杂,包括靶基因突变、靶基因扩增、DNA损伤修复能力差异、药物进入肿瘤细胞内浓度减少等。近来有研究认为化疗后残存的细胞具有干细胞特性,而肿瘤的复发、转移正是依赖这群细胞的大量增殖和分化实现的,同时这群细胞能够表达血管源性因子刺激间质形成,也是细胞产生了耐药性。上皮源性的肿瘤细胞可以在一些因素的作用下,丢失细胞间紧密连接和粘附链接,丧失上皮细胞特性,获得间质细胞的形态和特性。这种改变被定义为上皮-间质转化(Epithelial - mesenchymal transition,EMT)。EMT钙粘蛋白的减少为其主要特征性改变,E-cadherin是细胞间重要的黏附分子,E-cadherin具有抑制肿瘤侵袭转移的作用。丢失了E-cadherin的细胞呈现出非上皮样特征,细胞粘附力降低因而促进肿瘤侵袭与转移,为肿瘤获得去分化和侵袭力提供了基础。因此EMT是促进肿瘤细胞侵袭转移的主要因素之一。药物处理后残存的结肠癌细胞是否也通过EMT途径实现局部浸润和远处转移是本课题探讨的重点。EMT的发生受多种因素诱导和调控,一些转录因子、生长因子、Rho家族、micRNA等都可以诱导肿瘤细胞发生EMT。已证实的生长因子如TGFβ家族可通过PI3K/AKT、RAS-MAPK、Notch、Wnt等多条信号通路调控肿瘤发生EMT,增强肿瘤侵袭转移能力。本课题以TGF-β1因子诱导结肠癌细胞SW-480出现EMT现象作为为阳性空白对照组进行体外实验研究。肿瘤微环境影响着肿瘤细胞的生物学特性。纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是由上皮细胞,成纤维细胞,内皮细胞及部分癌细胞分泌的重要因子,是细胞外基质的重要组成成分,其三个可变剪接区域分别是EDA、EDB和ⅢCS。EDA片段在诸多恶性肿瘤中普遍呈高表达,但在良性肿瘤中表达不明显。结肠癌中EDA-FN表达明显高于正常陷窝结肠细胞及其周围的肌成纤维细胞,说明EDA-FN在维持结肠癌生物学特性中扮演了重要角色。Serini发现不同来源的成纤维细胞被TGF-β1刺激后, EDA-FN和a-SM肌动蛋白表达增高,推测可能由此途径促进了迁移。结肠癌细胞经TGF-β1刺激后发生的EMT是否也可以通过EDA-FN表达的变化实现,这也是本课题需要探讨的问题。本课题体外实验第一部分分三组,第一组应用5-Fu处理结肠癌细胞SW-480,第二组用C225处理结肠癌细胞SW-480,第三组用5-Fu和C225联合处理结肠癌细胞SW-480。处理后分别收集残存结肠癌细胞,即药物筛选残存细胞(drug surviving cells,DSCs)。设立以TGF-β1因子诱导结肠癌细胞SW-480出现EMT现象为阳性空白对照组。设立未经药物处理的细胞为空白对照组。检测DSCs的EMT特异性标记,与阳性空白对照组进行对比。同时检测多药耐药基因,进一步证明EMT与多药耐药的关系。为探讨EDA-FN片段对EMT的影响,体外实验第三部分构建EDA-FN基因干扰的慢病毒载体,稳定转染入正常人结肠癌细胞SW-480,得到细胞为SW-480i,同法将空载体转染入正常人结肠癌细胞SW-480,得到细胞为SW-480mock作为无关空白对照组,通过对细胞SW-480i和SW-480mock进行EMT特异性标记的检测探讨EDA-FN与人结肠癌细胞EMT的关系。方法1. TGF-β1因子诱导人结肠癌细胞系SW-480出现EMT现象,以此作为阳性空白对照组。未经任处理的人结肠癌细胞SW-480为空白对照组。倒置显微镜下观察阳性空白对照组细胞形态改变,同空白对照组做比较。免疫荧光化学方法染色观察阳性空白对照组中EMT特异性标记E-cadherin和Vimentin。Western blot方法检测阳性空白对照组细胞EMT特异性标记E-cadherin和Vimentin表达。2.分别采用6个递增浓度的5-Fu(1、2、2.6、3.5、10、100μmol/l)和C225(2、6、10、13、130、260μmol/l)持续处理正常人结肠癌细胞SW-480 12天,再分别用对应的6个浓度的两药联合处理人结肠癌细胞SW-480。每组分别于处理第4天采用体外药物敏感性实验(MTT法)测定细胞的存活率,并计算出半量抑制浓度(50% inhibition concentration,IC50),同空白对照组进行比较。3.分别选择接近5-Fu IC50的浓度16μmol/l和接近C225 IC50的浓度92μmol/l分别持续处理SW-480细胞12天后倒置显微镜下观察DSCs形态,同阳性空白对照组和空白对照组进行比较。免疫荧光化学方法分别检测各组DSCs的EMT特异性标记E-cadherin和Vimentin。收集各组DSCs,Western blot方法检测各组DSCs的EMT特异性标记E-cadherin、Vimentin和耐药相关蛋白MRP、P-gp的表达,与空白对照组和阳性空白对照组进行比较。4.构建EDA-FN基因干扰的慢病毒载体,稳定转染入正常人结肠癌细胞SW-480,得到细胞为SW-480i,同法将空载体转染入正常人结肠癌细胞SW-480,得到细胞为SW-480mock,倒置显微镜下观察SW-480mock和SW-480i细胞形态改变,同空白对照组做和阳性空白对照组比较。5.免疫荧光化学方法染色观察SW-480i、SW-480mock中EMT特异性标记E-cadherin。免疫荧光化学方法检测E-cadherin和Vimentin表达。Western blot方法检测细胞SW-480i、SW-480mock细胞E-cadherin和Vimentin表达,同阳性空白对照组比较。结果1. TGF-β1因子诱导人结肠癌细胞系SW-480出现EMT现象,倒置显微镜下观察失去细胞间紧密连接,细胞生长分散,上皮细胞排列开始呈极性铺展并伸长,表现出间质细胞形态。免疫荧光化学方法荧光定量分析得出E-cadherin表达下调,Vimentin表达增高(P<0.05),激光共聚焦显微镜下见细胞呈现间质形态。Western blot方法检测得出E-cadherin表达下调,Vimentin表达增高(P<0.05),同免疫荧光化学结果。3.应用6个递增浓度(2、6、10、13、130、260μmol/l)的C225持续处理12天后SW-480细胞存活率随浓度递增呈下降趋势,浓度为10、13、130、260μmol/l时,细胞存活率下降明显,与未处理组相比有差异(P<0.05),这四个浓度时细胞寻获率依次为(81.5±3.0)%,(65.4±3.1)%,(52.0±1.8)%,(22.7±0.4)%。计算得出IC50为85μmol/l。应用6个递增浓度的5-Fu(1、2、2.6、3.5、10、100μmol/l)持续处理人结肠癌细胞SW-480 12天后,细胞存活率随浓度递增而出现明显下降趋势,当浓度在2.6、3.5、10、100μmol/l时最显著,与未处理组相比有差异(P<0.05)。这四个浓度时细胞存活率依次为(77.9±0.2)%,(57.4±1.5)%,(44.7±0.3)%,(22.8±1)%。计算得出IC50为15.5μmol/。应用以上6个浓度的5-Fu和C225联合处理SW-480细胞12天后,细胞存活率分别为(79.4±3.7 )(84.1±4.0)(62.3±1.6)%,(44.1±2.4)%,(22.2±0.4)%,(16.9±0.2)%,与未处理组相比下降趋势更为显著(P<0.05),且效果优于单用5-Fu处理组。4.分别选择接近5-Fu IC50的浓度16μmol/l和接近C225 IC50的浓度92μmol/l分别持续处理SW-480细胞12天,观察发现5-Fu处理组细胞数量明显减少,DSCs形态发生改变,细胞生长较分散,上皮细胞排列开始呈极性铺展并伸长,表现出间质细胞形态,C225处理组细胞数量减少不明显,但DSCs同样出现了向间质细胞形态转化的趋势。再用16μmol/l的5-Fu和92μmol/l的C225联合处理SW-480细胞12天,发现细胞数料显著减少,DSCs形态向间质细胞转变更加明显。免疫荧光化学方法染色并经荧光定量分析显示5-Fu+C225组中E-cadherin降低,Vimentin表达升高(P<0.05)。Western blot方法检测5-Fu+C225处理后的DSCs E-cadherin降低,Vimentin表达升高(P<0.05)。5-Fu+C225处理后DSCs的MRP和P-gp表达均高于未经处理的正常结肠癌细胞SW-480 (P<0.05)。提示经5-Fu和C225虽然可以有效的杀死肿瘤细胞,且效果优于单用5-Fu,但处理后DSCs却具备了EMT特性,同时获得了耐药能力。5.成功构建EDA-FN基因RNAi干扰慢病毒载体,并转染入SW-480细胞,采用流式细胞技术进行细胞分选,GFP阳性率>70%,分选后细胞稳定传代培养,得到细胞为SW-480i,同法将空载体转染入正常人结肠癌细胞SW-480,得到细胞为SW-480mock作为无关空白对照组。倒置显微镜下观察发现SW-480mock细胞形态同空白对照组未见明显改变,仍呈现规则的上皮细胞形态。SW-480i细胞同阳性空白对照组相似,出现典型间质细胞形态。6.免疫荧光方法染色并进行光密度分析显示SW-480mock细胞高表达E-cadherin,低表达Vimentin,SW-480i细胞低表达E-cadherin,高表达Vimentin(P<0.05)。Westernblot方法检测SW-480mock细胞高表达E-cadherin,低表达Vimentin、TGF-β1,SW-480i细胞低表达E-cadherin,高表达Vimentin(P<0.05)。结果显示SW-480i细胞获得了间质细胞的特异性标记,出现EMT。结论1.结肠癌细胞在5-Fu、5-Fu+C225作用下细胞存活率下降明显,以5-Fu+C225为主。单独应用C225处理后结肠癌细胞存活率下降不明显。2. 5-Fu与C225联合作用于结肠癌细胞有效的抑制了结肠癌细胞的生长,细胞数量明显减少。残存的DSCs出现了EMT现象,同时获得了较强的耐药能力。说明即使5-Fu与C225联合作用可使大量结肠癌细胞被杀死,但始终残留的DSCs具备了耐药性,且DSCs的耐药与EMT有关。3.干扰结肠癌细胞的EDA-FN表达后,细胞相应地出现了EMT现象,推测EDA-Fn可能与结肠癌EMT有关。