神经生长因子基因修饰的许旺细胞治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察及其机制研究

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第一部分许旺细胞的取材、纯化和鉴定目的培养并纯化大鼠许旺细胞,为后续的实验提供细胞来源。方法取新生3-4天SD大鼠的坐骨神经和臂丛神经,采用Ⅳ型胶原酶消化的半植块培养法获取原代大鼠许旺细胞;然后用免疫磁珠分选法获纯化许旺细胞。用S-100抗体进行免疫组织化学染色鉴定许旺细胞并计算细胞纯度。结果取材后6-8小时可见到细胞贴壁,呈现出明显的梭形,遮光性强。免疫磁珠分选后可获得了高纯度的许旺细胞,免疫细胞化学染色见到大量的阳性细胞,阳性率达到95%以上。结论肤酶和胶原酶联合消化法联合磁珠分选法可以获得高纯度的许旺细胞,为后续的实验提供了细胞来源。神经生长因子基因载体的构建、转染及表达目的构建绿色荧光蛋白标记的神经生长因子基因表达载体,并检测其表达效率。方法采用双酶切法切取人神经生长因子基因序列,采用PCR法扩增,酶切后和载体EGFP-N1连接;感染感受态大肠杆菌后挑选单克隆菌株,提取质粒酶切鉴定证实为目的质粒后进行扩增。用Iipofectamine2000将质粒转染大鼠许旺细胞,用ELISA法检测神经生长因子表达量的变化。结果PCR凝胶电泳结果显示切取的片段约为750bp左右,和目的基因片段大小相符合;提取质粒后双酶切显示切取片段和目的基因的大小相符合;转然后24小时在显微镜下可见到明显的绿色荧光,一周后上清液中NGF的含量较对照组明显升高。结论成功构建出含有神经生长因子基因的EGFP-N1质粒,转染许旺细胞后能够促进NGF的表达。高表达NGF的许旺细胞移植治疗脊髓损伤的疗效及其机制探讨目的观察高表NG的许旺细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的效果,并探讨其作用的可能机制。方法用改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型,随机分为A、B、C、D四组,A组为转染含NGF基因的许旺细胞移植组,B组为许旺细胞移植组,C组为PBS对照组,D组为假手术组,造模一周后分别用108/ml含有转染NGF的许旺细胞的PBS液、108/m1许旺细胞的PBS液、PBS液注入A、B、C组大鼠脊髓损伤部位及其上下各5μ1。注射后一二、三、四周分别用BBB评分法观察大鼠双下肢运动功能,用肌电图检测大鼠的神经传导功能;处死后用免疫组织化学染色法检测脊髓损伤部位Bcl-2和6AP-43的表达变化。并取转染组的大鼠脊髓组织行纵行切片观察许旺细胞的迁移情况。结果各时间点BBB评分结果显示D组>A组>B组>C组;肌电图检测结果显示中枢潜伏时传导速度A、B、C组间差别有统计学意义P<0.05,中枢波幅A、B、C组间未见明显差异(P>0.05),D组明显高于其它三组; Bc1-2和GAP-43免疫组化检测结果提示A>B>C组,D组仅有少量表达。大鼠脊髓组织纵行切片观察显示在脊髓损伤后一周损伤区有大量的绿色荧光蛋白表达,随后随着时间的延长,大鼠脊髓损伤区内的许旺细胞数量逐渐减少。结论本研究证实NGF基因修饰的许旺细胞能够促进脊髓损伤的恢复,可能是通过抑制受损细胞的凋亡和促进神经轴突的生长有关。
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