罗非鱼是世界性经济鱼类,已成为继鲑科鱼和鲤科外第三大鱼类,是联合国粮食及农业组织（FAO）推荐的主要养殖经济鱼类之一。由于养殖环境和养殖条件的原因,引起罗非鱼大量发病及死亡,目前已造成了严重的经济损失,其中链球菌病对罗非鱼养殖产业的影响最为严重,其病原菌主要是无乳链球菌（Streptoccus agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）。目前,主要采取传统检测技术结合抗生素进行防治,操作费时费力,效果也不理想。分子检测和中草药防治已被证明具有很多优点,因此,建立一种早期预警的分子检测结合中草药进行防治技术具有很重要的意义。本文以PCR技术为基础,建立了罗非鱼链球菌早期分子检测技术并应用PCR检测技术监测对广东部分地区的无乳链球菌感染罗非鱼的周年变化。在此基础上,筛选了200种中草药,筛到了35种对罗非鱼链球菌有明显抑制效果的中草药,然后通过中草药的相关性组合得到了2个对罗非鱼链球菌具有显著抑制效果的中草药复方。1.无乳链球菌和海豚链球菌的特异性引物筛选。针对无乳链球菌和海豚链球菌表达环磷酸腺苷因子的cfb（Cyclic Adenosine monophosphate factor）基因、表面免疫相关蛋白的sip（Surface immunogenic protein）基因、溶血素的hly（Hemolysin）基因、疫苗抗原A的VaA（Vaccine antigen A）基因、热休克引诱的丝氨酸蛋白酶的htra（high temperature reguirement A）基因、纤维蛋白原结合蛋白的fbp（fibrinogen bingding protein）基因和16S核糖体RNA的16S rDNA（16S ribosomal DNA）基因的七个序列设计特异性引物,使用单对引物PCR的方法筛选了70对引物,最后获得了能分别对无乳链球菌和海豚链球菌特异性扩增的14对引物,这些引物对无乳链球菌和海豚链球菌基因组DNA的灵敏度均为5.6pg/μL。2.无乳链球菌和海豚链球菌三重PCR检测方法的建立。针对海豚链球菌（S.iniae）的fbpHT、HtrAHT和VaAHT的三对引物和无乳链球菌（S.agalactiae）的WRVaA、WRsip和WRHtrA的三对引物,分别建立了三重PCR技术。其中海豚链球菌基因组DNA和菌落的灵敏度分别是3.43 pg/μL和1.20×10² CFU/mL（Colony-Forming Units of Bacterial Cells）,无乳链球菌基因组DNA和菌落的灵敏度分别是1.27 pg/μL和1.48×10³ CFU/mL。3.同时鉴定无乳链球菌和海豚链球菌的二重PCR。用海豚链球菌的sip基因和无乳链球菌的16S rDNA基因的引物进行组合并优化扩增条件,建立同时检测这两种菌的二重PCR技术,无乳链球菌（S.agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）的基因组DNA灵敏度分别为9.84×10^-1 pg/μL和9.30×10^-1 pg/μL;无乳链球菌（S.agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）的菌液灵敏度分别为2.76×10²和2.51×10² CFU/mL。4.一对同时鉴定无乳链球菌（S.agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）的PCR引物。通过比对无乳链球菌、海豚链球菌及其他相关病原菌的基因组序列,设计一对特异性引物,其在无乳链球菌的基因组中可以扩出616 bp的目的片段,而在海豚链球菌的基因组中却只能扩出794 bp的目的片段,此方法对无乳链球菌（S.agalactiae）和海豚链球菌的灵敏度均为1.5 pg/μL的基因组DNA和5.8×10³ CFU/mL的菌液。另外,人工感染无乳链球菌（S.agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）罗非鱼组织样品的灵敏度均为10⁵ CFU/g。5.应用PCR检测技术监测无乳链球菌感染罗非鱼周年变化。为了解我国罗非鱼链球菌病爆发的特点,以最具代表性的广东省为例,分别在广州的番禺区、佛山、茂名和惠州东进行链球菌检测技术在周年调查中的应用。用本实验室建立的方法,共分离到了8株不同的病原菌,分析得出链球菌的爆发与溶解氧、水温、pH、亚硝酸盐和总磷都有很大关联。6.同时抗无乳链球菌和海豚链球菌的单种中草药筛选。筛选了200种中草药,发现对无乳链球菌和海豚链球菌都有抑制效果的有35种,其中香薷、补骨脂、香附、藿香、豨莶草、丹皮等17种效果显著。7.同时抗无乳链球菌和海豚链球菌的中草药复方筛选。挑选上述效果显著的刺五加、豨莶草、黄连、香附、诃子、马兜铃、桑白皮、槐角、丹皮和补骨脂10种中草药,做相关性实验。结合药效和药价,最终选定刺五加、豨莶草、黄连和香附四种中草药组合复方,获得复方4和5,两种复方不仅对无乳链球菌和海豚链球菌有很好的抑制效果,而且对罗非鱼其他病原菌的抑制效果也很明显。综上所述,本文针对无乳链球菌和海豚链球菌,建立了一种PCR分子检测技术,并应用此检测技术监测无乳链球菌感染罗非鱼的周年变化,最后通过筛选对这两种菌有抑杀效果的中草药和药物相关性组合得到了2个效果显著的中草药复方。