论文部分内容阅读
目的：皮肤T细胞的激活在创面愈合的启动阶段有重要的作用，人皮肤T细胞无法免疫激活可能是慢性创面形成的主要原因之一。研究发现小鼠皮肤T细胞表面表达的连接粘附分子样蛋白（JAML）是创面愈合启动阶段中促进皮肤T细胞激活的重要共刺激分子。人体内也有JAML的表达，但其是否具有类似作用尚未得到验证。因此，我们提取了人皮肤αβT细胞和γδT细胞，用与JAML相关的多种激活剂和阻滞剂对其进行干扰，并测定其对干扰的不同反应，观察JAML是否具有作为人创面愈合启动阶段促进皮肤T细胞免疫激活的重要共刺激分子的能力，旨在进一步探索创面愈合过程中人皮肤T细胞的激活活化的细节，深化对创面愈合过程中免疫学机制的认识。材料与方法：1.从组织中提取人皮肤T细胞，观察提取细胞的活性，检测皮肤T细胞的数量和表型。2.用100ng/ml的PMA和1000ng/ml的ionomycin满负荷刺激外周血T细胞及人皮肤T细胞，检测不同T细胞合成IL-2和IGF-1的水平。3.分别对外周血T细胞及人皮肤T细胞进行培养扩增，观察不同T细胞的扩增能力。4.采用不同剂量的anti-CD3mAb（0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）刺激人皮肤T细胞，检测其表面激活标志CD25、CD69的表达以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。5.用4μg/ml重组柯萨奇-腺病毒受体蛋白（CAR）联合0.5μg/ml anti-CD3mAb或单独4μg/mlCAR刺激人皮肤T细胞，检测其表面激活标志CD25、CD69的表达以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。6.将人皮肤αβT和γδT细胞分离，检测其表面JMAL和CD28的表达。7.从人皮肤T细胞中提取人皮肤γδT细胞，分别用4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb，单独4μg/ml CAR或单独0.5μg/mlanti-CD3mAb刺激，检测其表面激活标志CD25、CD69和表面共刺激分子CD80、CD86、JAML的表达，以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。8.从人皮肤T细胞中提取人皮肤αβT细胞，用4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激，检测其表面激活标志CD25、CD69和表面共刺激分子CD80、CD86、JAML的表达，以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。再分别用4μg/ml CAR或0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激，检测其表面共刺激分子CD28的表达。9.用激活的人皮肤γδT细胞和0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激人皮肤αβT细胞，检测人皮肤αβT细胞表面激活标志CD25、CD69的表达。结果：1.从组织中提取的人皮肤T细胞活性良好，平均每克表皮组织能提出T细胞（2.63±1.72）×107个，αβT细胞：γδT细胞为7.3±1.08；每克真皮组织能提出T细胞（1.95±1.31）×107个，αβT细胞：γδT细胞为6.7±1.31。两者在细胞数量及细胞亚群之间的比例上差异不明显。皮肤中的γδT细胞均为Vδ1+细胞，未见Vδ2+细胞。2.在PMA和ionomycin的满负荷刺激下，外周血T细胞及人皮肤T细胞的IL-2和IGF-1合成水平明显升高，不同T细胞之间的合成水平无明显差异。3.外周血αβT细胞和γδT细胞，及人皮肤αβT细胞被成功扩增，人皮肤γδT细胞扩增失败，外周血和人皮肤αβT细胞的扩增倍数明显高于外周血γδT细胞。4.高于2μg/ml的anti-CD3mAb可激活人皮肤T细胞，细胞表面CD25和CD69表达上调，分泌IL-2和IGF-1增多。5.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb可激活人皮肤T细胞，细胞表面CD25和CD69表达上调，分泌IL-2和IGF-1增多。单独4μg/ml CAR刺激不能激活人皮肤T细胞。6.人皮肤αβT细胞表面无JAML的表达，CD28的表达率为45.59±5.73%；人皮肤γδT细胞无CD28的表达，JAML的表达率为8.56±2.19%。7.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb可激活人皮肤γδT细胞，细胞表面CD25、CD69、CD80、CD86、JAML表达上调，分泌IL-2和IGF-1增多。单独4μg/ml CAR或单独0.5μg/mlanti-CD3mAb刺激不能激活人皮肤γδT细胞。但单独0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激能使人皮肤γδT细胞表面JAML表达上调。8.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb不能激活人皮肤αβT细胞，但能使细胞表面CD28表达上调。单独0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激也能使人皮肤αβT细胞表面CD28表达上调，单独4μg/ml CAR刺激对人皮肤αβT细胞表面CD28表达无影响。9.激活的人皮肤γδT细胞联合0.5μg/ml anti-CD3mAb可激活人皮肤αβT细胞，细胞表面CD25、CD69、表达上调。结论：人皮肤T细胞分为αβT细胞和γδT细胞，JAML是协助全体人皮肤T细胞激活的重要共刺激分子，能为人皮肤γδT细胞的激活提供第二信号，协助其激活；而激活的人皮肤γδT细胞能为人皮肤αβT细胞提供激活所需的第二信号，协助其激活。提示创面中全部人皮肤T细胞的激活可能是通过先激活人皮肤γδT细胞，再由激活的人皮肤γδT细胞协助人皮肤αβT细胞的激活这个顺序进行的。