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酶受外界刺激会出现一种过渡态,中间体是过渡态中相对稳定的一种结构。这种结构相对于天然态的结构更为松散,而相对于完全变性的结构更为有序,是一种较为稳定的高活性状态。酶解是在食品工业中一个重要的生物化学反应,超声处理是提高酶活的重要措施之一。本文以胰蛋白酶和胃蛋白酶为研究对象,以尿素诱导变性为对照,利用过渡态理论,研究了聚能式、狭缝发散式、平板发散式等不同工作模式超声对蛋白酶诱导激活和中间体形成的影响,研究了酶活变化与折叠中间体的相关关系,分析了蛋白酶中间体的热稳定性、二级结构及热力学参数,以期深入揭示蛋白酶活性变化的机理。主要研究工作及结果如下:(1)研究了不同工作模式超声对胰蛋白酶结构及其活性的影响。胰蛋白酶经过0-8 M的尿素诱导24 h、0-7×103 W/L的聚能式超声诱导5 min、20-180 W/L的狭缝发散式超声诱导20和30 min的过程中,各出现1个折叠的中间体,为1T、2T、5T和6T,其酶活比对照分别提高30.3%、21.6%、31.8%和31.2%。胰蛋白酶经过聚能式超声诱导7.5 min的过程中出现2个中间体,为3T和4T,其酶活前者低于对照14.1%、后者提升21.6%。胰蛋白酶经过狭缝发散式和聚能式超声各10 min以及平板发散式超声10、20和30 min,均不能诱导出中间体。因此,狭缝式超声诱导20 min,胰蛋白酶中间体5T酶活性最高。(2)研究了狭缝发散式超声频率及其组合对胰蛋白酶结构及其活性的影响。胰蛋白酶在28、33和40 kHz下经过20-180 W/L的狭缝发散式单频超声诱导20 min的过程中,各出现1个折叠的中间体,为5T、7T和8T,其酶活分别提高了31.8%、42.4%和32.0%,筛选出最佳单频频率为33 kHz。以33kHz为基础,在频率组合33/28和33/40 kHz下经过20-180 W/L的狭缝发散式双频超声诱导20 min的过程中,各出现1个高酶活折叠的中间体,为9T和10T,酶活分别提高44.5%和28.1%;在20、23、25 kHz单频以及在33/20和33/25 kHz双频超声均不能诱导出中间体。所以,在33/28 kHz下诱导的胰蛋白酶中间体9T酶活性最高。(3)对上述诱导的5个胰蛋白酶中间体进行了热稳定性、二级结构及热力学参数分析。5个中间体酶活性、残余酶活以及酶活残留率与对照相比显著提高,其中中间体9T酶活最高,但热稳定性最低,中间体8T的热稳定性最好;除中间体7T外,其余胰蛋白酶中间体的二级结构与对照相比有显著差异;热力学参数研究表明,上述所有中间体的反应速率显著增加,反应吸收的热量显著减少,结构的混乱程度显著减小,反应难易程度与对照相比无显著差异,其中中间体9T的热力学参数变化最显著。(4)研究了不同工作模式超声对胃蛋白酶结构及其活性的影响。胃蛋白酶经过0-8 M尿素诱导24h、20-180 W/L的狭缝发散式超声诱导20和30 min的过程中,各出现2个折叠的中间体,分别为1p、2p、5p、6p、7p和8p。尿素诱导的2个中间体活性前者提高21.0%、后者降低15.3%,狭缝发散式超声诱导的4个中间体酶活分别提高了41.7%、27.1%、22.3%和17.2%。经过0-7×103 W/L的聚能式超声诱导5和7.5 min的过程中,各出现1个折叠中间体,分别为3p和4p,其酶活分别提高27.8%和20.9%。狭缝发散式和聚能式超声各10 min以及平板发散式超声10、20、30 min均不能诱导出胃蛋白酶形成中间体。狭缝式超声诱导20 min的胃蛋白酶中间体5p酶活性最高。(5)研究了狭缝发散式超声频率及其组合对胃蛋白酶结构及其活性的影响。胃蛋白酶在单频25和33 kHz下经过20-180 W/L的狭缝发散式单频超声处理20min的过程中,各出现1个折叠的中间体,为9p和10p,酶活前者提高27.6%、后者降低12.7%;胃蛋白酶在单频28 kHz下诱导过程中出现了2个折叠中间体,为5p和6p,酶活分别提高41.3%和27.1%,因此28 kHz为最佳单频诱导频率。以28kHz为基础,频率组合28/25kHz、28/33 kHz分别出现2个折叠中间体11p、12p、13p和14p,其酶活分别43.1%、33.8%、62.7%和32.3%。20、23、40 kHz单频以及28/20、28/23和28/40 kHz双频超声均不能诱导出中间体。28/33 kHz双频狭缝发散式超声诱导的胃蛋白酶中间体13p酶活性最高。(6)对上述诱导的8个胃蛋白酶中间体进行了热稳定性、二级结构及热力学参数分析。胃蛋白酶除中间体10p外的其余中间体的酶活性、残余酶活与对照相比显著提高,其中中间体13p酶活最高,热稳定性第三高,中间体11p的热稳定性最好。除中间体10p、12p和14p的二级结构有显著差异,其余胃蛋白酶中间体与对照相比无显著差异。热力学参数表明上述所有中间体的反应速率显著增加,反应吸收的热量显著减少,结构的混乱程度显著减小,反应难易程度与对照相比无显著差异,其中中间体13p的热力学参数变化最显著。