从分子生物学水平上研究生物大分子，是微生物检测发展的趋势。这种以微生物的基因为检测靶标的检测方法，既能够克服以微生物表型特征为基础检测方法的缺点和影响因素，从根本上对微生物进行鉴别和特征分型，同时能够大大缩短检测时间，提高检测灵敏度和特异性。基因芯片技术是近年来发展起来的一项新的核酸检测实验技术,具有快速、敏感、高效、高通量等优点，已逐渐应用于DNA测序、基因表达谱分析、基因多态性分析、药物开发、基因诊断等多个领域。但目前的病原体检测芯片，在探针设计上，多采用病原体特异性基因片段为探针，虽然特异性强，但各探针序列长、结构复杂，Tm值、GC含量、长度差异大，很难保证芯片上所有的探针分子能在相同条件下充分杂交，使芯片可靠性降低。在分子标记上，多采用荧光素为报告分子，灵敏度低，检测条件高,数据的读取与分析需要昂贵的仪器设备。因此目前的病原体检测芯片检测内容单一，目标菌数量较少，操作复杂，设备要求高，难以在临床广泛应用。本研究针对目前临床检测用基因芯片的主要缺点，采用寡核苷酸探针和纳米金信号放大技术，研究能快速、准确地检测和鉴定病原体的高通量的、操作简便、适合临床使用的基因芯片检测技术。实验主要分为两部分，首先通过文献检索和临床调查，把临床上常见的一些感染病原体以及一些临床少见但非常重要的病原体作为检测目标，比较选择经验证并得到公认的各病原体种、型保守基因片段作为其特征性核酸标志，用于各病原体的检测和鉴定。设计、筛选出特异性寡核苷酸探针，并制成膜芯片用于样品的检测以验证其可靠性。然后，选用醛基修饰的玻片为载体，氨基修饰探针制作芯片。通过检测不同探针浓度对探针固定效率及杂交效率的的影响，确定最佳点样浓度。建立了纳米金核酸标记方法和杂交信号银染放大检测方法。并将该芯片检测技术用于临床样品的检测，确定其临床实用性及可靠性。实验的主要方法及结果如下：1. 通过查阅文献报道并进行临床调查，确定20余种临床常见的感染病原体以及一些临床少见但非常重要的病原体为检测目标，包括细菌、病毒、真菌及耐药基因。完成了各靶病原体特征性核酸标志的确定以及扩增引物的设计。完成了12个病原体及一个耐药基因PCR扩增方法，包括：金黄色葡萄球菌、<WP=8>2. 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、乙肝病毒、丙肝病毒以及mecA基因等，并对扩增条件进行优化，使各扩增反应能在相同的扩增条件下完成。3. 在相同条件下设计了各靶病原体特异性寡核苷酸探针，利用生物信息学方法对探针进行计算机模拟筛选，并利用同位素标记靶序列对探针的特异性、可靠性的指标进行检测，并确定了杂交条件。结果显示探针间Tm值相差仅0.4℃，各探针在G+C含量、发夹结构、自身二聚体以及重复碱基数等指标均符合寡核苷酸探针设计要求，所选用探针特异性强，具有相同的杂交条件。4. 将筛选出的检测探针、阳性对照探针以及阴性探针点在尼龙膜上制成膜芯片，用于样品的检测，相应检测探针点及阳性对照均有杂交结果，阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果，背景清晰，结果可靠。证明本检测方法准确可靠，可用于各靶序列的检测。5. 为确定最佳点样探针浓度，进行了探针浓度对探针固定效率和杂交效率的影响研究。结果探针浓度从5nM到4000nM变化时，其固定效率先迅速增加，在浓度达到1500nM后趋于平缓。与靶序列杂交后其杂交点信号强度值在高于1500nM的探针高浓度区，反而呈下降趋势。表明点样探针浓度为1500nM时可获得较好的固定率和杂交效率，因此将制备芯片的探针浓度确定为1500nM。6. 实验结果显示，用纳米金标记样品同芯片杂交，银染显色，其最低检测值可达100fM，同目前常用的cy3为报告分子的方法相比，其灵敏度要高出50倍，且检测结果可以用肉眼或普通光学仪器记录。7. 临床样品的检测结果显示，阳性探针点及阳性对照点均有显色结果，阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果，背景清晰，结果可靠。检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致，证明本检测方法准确可靠，可用于临床样品的检测。以上实验结果表明：该芯片检测技术灵敏度高，特异性好，不需要特殊设备，操作方法简单，能部分满足临床检测的通量要求，具有很好的临床应用前景。