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神经炎症反应在包括阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中等多种疾病的发生及发展过程中发挥重要作用,被认为是多种神经系统疾病发生共有的病理生理机制。星形胶质细胞激活在神经炎症反应中的作用日益受到重视,其可促进小胶质细胞激活,并加剧自身激活,在神经炎症反应中起到放大作用。神经炎症常常可引起神经元的损伤。本论文研究拟从星形胶质细胞激活及神经炎症导致神经元损伤两方面展开研究。课题组在前期对中枢神经系统差异蛋白组学进行筛选,发现Src抑制的蛋白激酶C的底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)与早幼粒白血病锌指蛋白(Promyelocytic Leukemia Zinc Finger,PLZF)的表达存在显著差异。课题组前期的的研究发现SSeCKS在星形胶质细胞激活中发挥关键的调节作用,但是其作用机制需要做进一步的探讨。研究表明PLZF可调节细胞的增殖和凋亡及细胞周期过程,然而PLZF在神经炎症导致的神经元损伤中的作用不清楚。鉴于此,本课题拟分为两个部分展开,第一部分分析星形胶质细胞中SSeCKS调节作用的分子机制;第二部分分析PLZF在神经炎症中的表达及其在神经元损伤中的作用。两个部分内容分别为:第一部分 SSeCKS调节TAK1的激活在星形胶质细胞活化中的作用背景:星形胶质细胞激活在神经炎症反应中发挥重要作用。课题组前期的研究发现SSeCKS在星形胶质细胞激活中发挥调节作用,但是其作用机制不清楚。目的:研究SSeCKS与转化生长因子β活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)结合在星形胶质细胞激活中的作用及其调节机制。方法:分离培养大鼠原代星形胶质细胞,运用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激星形胶质细胞诱导细胞活化。构建SSeCKS及TAK1的表达及干扰载体,转染细胞。免疫印迹检测蛋白的表达变化,免疫共沉淀检测相互作用变化。ELISA检测细胞的炎症因子释放。结果:星形胶质细胞运用 Ong/ml、1ng/ml、10 ng/ml、100ng/ml、1μg/ml 及 10μg/ml的LPS处理原代星形胶质细胞6h,发现随着浓度的增加,SSeCKS及TAK1的表达呈现增高的趋势,且在1μg/ml时达到最高。TAK1的磷酸化也随着浓度的增加逐渐增加。用1μg/ml的LPS处理细胞Oh、1h、3h、6h、12h、24h,发现SSeCKS及TAK1的表达随着时间的延长而增加,并且TAK1的磷酸化修饰在6h达到最高,然后逐渐下降。利用SSeCKS抗体(AKAP250)进行免疫共沉淀,利用TAK1及SSeCKS的抗体进行检测,发现两者的相互作用在不同浓度LPS处理时1μg/ml的LPS处理时达到最高,且两者相互作用随着时间延长而增加,在6h时达到最高。在HEK293T细胞中,分别转染SSeCKS及TAK1,运用免疫共沉检测显示SSeCKS可以TAK1结合,且外源性的蛋白结合也在LPS处理后增加。分别构建了 SSeCKS及TAK1的截短突变载体转染HEK293T细胞,免疫共沉淀结合免疫印迹检测两者的相互作用发现SSeCKS与TAK1的结合是多部位的结合,而TAK1通过其N末端及C末端与SSeCKS结合。LPS处理促进两者结合可被蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制剂所抑制,且星形胶质细胞的激活在PKC的抑制剂处理时也被抑制。质膜分离,检测SSeCKS与TAK1的亚细胞分布发现LPS处理可导致SSeCKS的增加,增加的SSeCKS主要位于细胞质中,同样TAK1的表达及其激活也主要是在细胞质中,SSeCKS可通过自身的细胞质定位,从而促进胞质的分布,促进TAK1的激活。星形胶质细胞中干扰SSeCKS及TAK1的表达阻断两者相互作用后,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)的 p38 信号、AKT 信号转导被抑制,细胞激活的标记物胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)也被抑制。此外TAK1结合蛋白肿瘤坏死因子受体相关分子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)及 TAK1 结合蛋白 1(TAK1-Binding Protein 1,TAB1)的表达及炎症因子肿瘤坏死因子α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)的分泌也被抑制。结论:星形胶质细胞激活过程中SSeCKS与TAK1的表达随着细胞激活而增加,且SSeCKS与TAK1的相互作用随着细胞的激活而增加。SSeCKS可通过促进TAK1的磷酸化,从而促进下游的P38及Akt信号转导,从而促进星形胶质细胞激活。第二部分 PLZF在神经炎症诱导的神经元损伤中的作用背景:神经炎症可导致神经元的损伤,但是其机制不清楚。PLZF可调节细胞的增殖和凋亡及细胞周期过程。然而,PLZF在神经炎症导致的神经元损伤中的作用不清楚。目的:研究PLZF在神经炎症反应导致神经元损伤中的作用及其调节机制。方法:构建LPS注射导致的神经系统炎症模型,免疫印迹检测蛋白表达,免疫组化检测蛋白定位,免疫荧光检测蛋白的细胞分布。分离培养皮层神经元,构建炎症损伤模型,siRNA转染干扰蛋白表达,检测神经元存活。结果:LPS 注射后,分别于 Oh、3h、6h、9h、12h、1d、3d、5d 及 7d 检测 PLZF的表达,发现PLZF的表达在9h开始增加,在第3天达到高峰。免疫组织化学染色显示PLZF在假手术对照皮层中相对较低,LPS注射后3天染色显著增加。免疫荧光标记发现PLZF与神经元核抗原(Neuronal Nuclei,NeuN)阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞及CD11b阳性的小胶质细胞均有共标,但是增加的PLZF主要在神经元中。进一步发现LPS注射后激活的半胱天冬酶3(caspase-3)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)表达是以时间依赖性的方式,并且在第3天达到最高,其大致与PLZF表达一致。免疫荧光显示活化的caspase-3阳性细胞在神经元中共定位。构建混合胶质细胞条件培养基(conditioned media,CM)处理神经炎症模型发现PLZF的表达上调,且激活的caspase-3、cyclinD1和CDK4表达的也上调。使用siRNA来敲低神经元细胞中PLZF的表达,发现活性caspase-3、cyclinD1和CDK4的表达减少。深入的检测神经元凋亡发现敲低PLZF的表达能抑制神经元凋亡。结论:PLZF在神经炎症反应的脑组织中表达上调,表达增加的PLZF主要定位在神经元中,与神经元的损伤相关。体外干预皮层神经元中PLZF的表达能抑制CM诱导的神经元损伤。