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研究目的:肺癌是一种高发生率和高致死率的恶性肿瘤。根据其病理类型主要分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占所有病例中的80%。虽然肺癌的靶向性治疗取得了一定的效果,如某些常用的靶向EGFR或肿瘤相关激酶的化疗药物以及近年来较为热门的免疫治疗,然而化疗耐药性和个体对于免疫治疗的反应差异性问题渐渐表现出来。之前的研究表明,炎症与恶性肿瘤发生发展过程之间存在显著的相关性。值得一提的是,肺部炎症与肺癌的发生也存在紧密的联系NALP3是炎症小体激活过程中一个十分关键的组成部分,而NALP3在肺癌发生发展中的作用未见报道。本研究旨在探究炎症分子NALP3调控非小细胞肺癌细胞生长的作用机制及其临床的预后价值。研究方法:1:Western blot技术分析相关蛋白质的表达水平,实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)技术用于分析相关蛋白质分子的message RNA(mRNA)的水平;2:应用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测对照组细胞与NALP3敲低组细胞的生长速率,绘制不同处理后细胞的生长曲线;平板克隆形成实验研究NALP3下调后细胞的体外生长能力;3:通过裸鼠荷瘤实验评价NALP3下调后非小细胞肺癌细胞A549的体内生长能力;4:应用XF96 Seahorse细胞生物能量分析仪检测细胞在不同处理后的细胞氧耗率和产酸率的变化;5:应用葡萄糖摄入检测试剂盒与乳酸产生量检测试剂盒检测不同处理下细胞A549细胞和H1299细胞对葡萄糖的摄入和乳酸的生成量;6:应用DCFH-DA细胞活性氧检测试剂盒检测对照组与NALP3敲低组细胞的总活性氧水平;7:通过粗提线粒体,应用分光光度法对NALP3敲低及对照组细胞线粒体呼吸链复合体I,II,III,IV的变化;8:通过蛋白质免疫共沉淀实验研究NALP3与DMAP1之间的相互作用;9:构建Tissue Micro Array(TMA),并应用免疫组织化学印迹研究石蜡包埋的肺癌组织切片NALP3的蛋白质表达水平;10:应用χ~2检验统计方法分析NALP3表达水平与非小细胞肺癌患者各临床病理参数之间的相关性,以及采用COX风险比例模型评估各参数的风险比例;11:应用Kaplan-Meier生存分析方法分析不同NALP3表达量的非小细胞肺癌患者术后生存情况。研究结果:1:结果表明:炎性相关分子NALP3、NF-?、STAT3和IL-1的蛋白质水平与mRNA在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中显著高表达;2:在不同的非小细胞肺癌细胞系中,NALP3均有表达,并且在A549和H1299细胞中通过下调NALP3可显著抑制肿瘤细胞的克隆形成能力,体外细胞生长和体内裸鼠成瘤能力;3:在非小细胞肺癌细胞A549和H1299细胞系中,通过干扰NALP3的表达可显著增加细胞的氧耗率(Oxygen consumption rate);同时,细胞的有氧糖酵解速率(Extracellular acidification rate)有显著的降低;4:下调NALP3后,细胞的活性氧水平显著升高,mtDNA拷贝数相比于对照组有所增加;5:敲低NALP3后细胞葡萄糖摄入和乳酸产生量显著降低,催化有氧糖酵解过程相关酶有不同程度的降低;同时在敲低NALP3后促进了线粒体的生物合成及线粒体呼吸链复合体活性;6:NALP3可与DMAP1直接结合,下调NALP3可显著抑制DNMT1的蛋白质稳定性;7:敲低DNMT1可促进细胞有氧糖酵解向氧化磷酸化转化;8:DNMT1在非小细胞肺癌肿瘤组织中显著高表达,敲低DNMT1可显著抑制A549和H1299细胞生长;9:免疫组织化学技术结果表明,NALP3在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中的表达量较正常肺组织中有显著的升高,通过Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明,较高NALP3蛋白质表达的非小细胞肺癌患者较NALP3低表达患者的具有较短的术后生存期;10:χ~2检验结果显示,NALP3的高表达与患者的TNM分期,病理分级和转移之间存在显著的相关性;单因素风险因素分析结果表明NALP3是非小细胞肺癌患者较差预后的一个风险因素。结论:通过本文的研究,我们首先发现炎症关键分子NALP3在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中显著高表达。通过RNA干扰技术沉默NALP3后并不引发细胞凋亡,但可显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549和H1299的体内和体外细胞生长能力,提示NALP3在调控肿瘤生长中的关键作用。此外,NALP3下调后细胞代谢方式发生重编程(表现为细胞氧耗率升高,糖酵解速率降低),这一代谢转换是逆转warburg效应的一个表现,推测NALP3促进肿瘤生长可能是通过对细胞代谢进行重编程。本文还发现NALP3可与DMAP1直接结合并调控DNMT1的蛋白质水平,从而调控细胞的代谢重编程。最后,组织芯片的免疫组化结果提示NALP3的高表达与患者的预后存在显著正相关,同时NALP3的表达与TNM分期,病理分级和转移密切相关,并可作为患者预后的一个风险因素。本研究通过对NALP3的相关生物学功能以及临床样本的检测,初步探讨了炎症关键分子NALP3调控非小细胞肺癌细胞生长的作用机制,推测NALP3可能通过对细胞的代谢进行重编程从而参与非小细胞肺癌肿瘤发生发展过程,期望能够为非小细胞肺癌的早期诊断和治疗提供新的标志物和作用靶点。