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PUF家族蛋白是一类高度保守的RNA结合蛋白,在真核生物的基因转录后调控中起着重要的作用,同时对于低等动物和哺乳动物,PUF同源基因在生殖细胞和配子的发育过程中也起着重要的作用。目前关于果蝇和线虫PUF蛋白的研究有很多,但是对哺乳动物PUF蛋白表达的研究还比较少,PUF蛋白在哺乳动物生长和发育过程中的功能还不明确。本论文主要以小鼠为研究对象,运用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验,分别从mRNA水平和蛋白水平进行系统研究,结果表明PUF家族(Puml和Pum2)在野生型成年小鼠多个组织以及发育中不同时间点小鼠睾丸中均表达。利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验在细胞、亚细胞水平检测Puml和Pum2蛋白在小鼠高表达组织中的定位。本文还从生物化学角度出发,用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNABinding Protein Immunoprecipitation,RIP)技术寻找与PUF蛋白复合物结合的RNA,这些RNA很可能是PUF蛋白的下游作用靶标,通过Western Blot实验和Real time-PCR的验证,获得了与推测相符的结果。本课题研究内容和结论如下:1.利用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学等方法分别从mRNA和蛋白水平研究Pum 1在小鼠多个组织及生殖发育中的表达情况,结果表明,Puml蛋白在小鼠各个组织中均有表达,在睾丸中表达最高,且Puml在小鼠出生后不同时间点(出生后3天—成年)睾丸中均表达,但表达水平存在量的差异,提示Pum1参与调控精子发生的过程。组织细胞水平定位结果为:Pum1蛋白在小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞和支持细胞的细胞质,卵巢的初级卵母细胞、次级卵母细胞及黄体颗粒细胞的细胞质,皮肤表皮细胞、毛囊和皮脂腺体的细胞质中表达。同时用荧光定量PCR方法检测了人睾丸、脾和胆囊组织中PUM1 mRNA的分布情况,结果显示PUM1也在睾丸中高表达。用免疫组织化学实验对人睾丸(73岁男性)中PUM1蛋白进行定位,结果显示PUM1存在于精母细胞的细胞质中。2.利用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学等方法分别从mRNA和蛋白水平研究Pum2在小鼠多个组织及生殖发育中的表达,结果表明,Pum2蛋白在小鼠多个组织中均有表达,在睾丸中表达量最高,且Pum2在小鼠出生后不同时间点(出生后3天—成年)睾丸中均有表达,与Pum1的表达情况相似。免疫组织化学方法在细胞水平定位结果为:Pum2蛋白在小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞、圆形精子、变形精子和成熟精子的细胞质,卵巢的卵细胞、初级卵母细胞、次级卵母细胞、黄体颗粒细胞的细胞质,皮肤表皮细胞、毛囊和皮脂腺体以及脑组织的灰质细胞的细胞质中表达。同时用荧光定量PCR方法检测了人睾丸、脾和胆囊组织中PUM2 mRNA的分布情况,结果显示PUM2也在睾丸中高表达。用免疫组织化学实验对人睾丸(73岁男性)中PUM2蛋白进行定位,结果显示PUM2存在于精原细胞和精母细胞的细胞质中。3.利用RNA结合蛋白免疫沉淀技术在小鼠睾丸中寻求到与Puml和Pum2蛋白结合的具体RNA或其复合物。荧光定量PCR验证的结果表明,Ypel3、Cdkl、Cdk2、cyclinE2、Mdm2、Pias1 和 Pias2在Pum1 RIP实验中富集,可能为Pum1的下游靶标mRNA,Ypel3、Cdk1、Cdk2、cyclinE2、Map2k3、Pias1、Pias2、p27和ERK2在Pum2 RIP中富集,可能为Pum2的下游靶标mRNA。利用蛋白质免疫印迹实验研究了 Pum1和Pum2蛋白的相互作用关系以及对它们对相关细胞周期蛋白的影响,结果表明,Pum1敲除小鼠中的Pum2升高,p27升高,Pum2敲除小鼠中的Pum1变化不明显,p27升高,因此在正常小鼠体内,PUF家族的功能是通过调控p27的表达来影响小鼠的生长发育。