桑椹菌核病俗称白果病,根据病原及病症的不同,将其分为三类:桑椹肥大性菌核病、桑椹缩小性菌核病及桑椹小粒性菌核病。不同类型桑椹菌核病虽然病原菌不同,但侵染循环基本一致,且病害遍布全国各地,给果桑产业造成极大的危害。目前,桑椹菌核病主要是采用化学农药和农艺措施进行防治。然而,农艺措施防效甚微,化学农药的过量使用不仅使病原菌产生耐药性,而且带来农药残留、环境污染、威胁桑果食用和桑叶养蚕等问题。因此亟需寻找新的安全、高效、环境友好生物防治方法。植物内生菌广泛分布于陆生及水生植物体内,以植物为栖息场所。植物内生菌作为新型生防因子,能定殖于健康植物的各种组织和器官中,与植物建立和谐关系,并可通过合成抗菌活性物质、诱导植物抗性和促进植物生长等机制提高宿主植物抗病性。内生菌受环境条件的影响较小,能在植物体内长期定殖和传导,发挥生防作用,已经成为植物病害生物防治中潜在的生防菌而备受重视。本文从发病桑椹和子实体中分离桑椹缩小性菌核病病原菌和桑椹肥大性菌核病病原菌,从形态学和分子生物学水平进行鉴定,并对其培养特性进行研究。进而以分离获得的桑椹菌核病病原菌为靶标,从健康桑树中筛选、鉴定具有显著而稳定拮抗作用的内生菌。并研究内生拮抗菌对桑树种子萌发和幼苗生长的影响,为利用桑树内生菌进行桑椹菌核病的生物防治奠定研究基础。本研究主要取得了以下结果:1.桑椹菌核病病原菌的分离、鉴定和培养特性研究从经表面消毒的梭状子实体及缩小性桑椹病椹中分离病原真菌,共获得101个分离株,12株经ITS序列分析,及形态学研究,鉴定为蜡钉菌目(Helotiales)、地舌菌科(Geoglossaceae)、核地杖菌属(Scleromitula)、桑椹核地杖菌(Scleromitula shiraiana)。其中Scleromitula shiraiana SXSG-5分离株的田间回接实验发现,盛花期接种该菌菌丝的桑椹呈现出明显的缩小性菌核病症状,且经组织分离法再次获得桑椹核地杖菌(Scleromitula shiraiana)。培养特性研究结果表明,S.shiraiana sxsg-5能在多种培养基上生长,在马铃薯葡萄糖培养基(pda)和桑叶汁琼脂培养基上生长较快,在桑叶汁马铃薯葡萄糖培养基上有大量的菌丝,最适生长温度为20℃,最适ph为6.0,光照对该菌生长的影响较显著,全光照条件下菌株生长最快。从经表面消毒的盘状子实体中分离病原真菌,得到27个分离株,11株经its序列测定分析,及形态学观察,鉴定为子囊菌亚门(ascomycotina)、锤舌菌纲(leotiomycetes)、肉膜菌目(helotiales)、核盘菌科(sclerotiniaceae)、核盘菌属(sclerotinia)、核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)。其中,sclerotiniasclerotiorumpz-2分离株的回接实验结果表明,其能引起果桑肥大性菌核病,且经组织分离法能再次获得核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)。sclerotiniasclerotiorumpz-2菌株的培养特性研究发现:该菌能在多种培养基上生长,其中在pda、营养琼脂培养基(na)、桑叶汁马铃薯葡萄糖培养基、桑叶汁琼脂培养基上均生长迅速,3天即可布满90mm平板。病原菌在20℃到25℃范围内生长最快,ph和光照条件对该菌生长影响不显著。2.拮抗菌的分离、鉴定、抑菌谱测试及培养特性研究以分离获得的桑椹菌核病病原菌s.shiraianasxsg-5和s.sclerotiorumpz-2为指示菌,从健康桑树的内生菌中筛选对其有显著而稳定抑制作用的菌株,并通过形态学和分子生物学特征的研究,完成拮抗菌的鉴定工作。从健康实生桑茎中分离获得一株内生菌saj-1,其三周培养物对桑椹核地杖菌scleromitulashiraianasxsg-5抑菌率为98.07%,对核盘菌sclerotiniasclerotiorumpz-2的抑菌率为93.42%,且抑菌作用稳定。saj-1菌株在pda、wa和oa培养基上培养12周,可在培养基表面产生分生孢子器。分生孢子器呈球形、扁球形,单生或丛生,顶部突起,具孔,大小98.0~126.9μm×158.3~186.0μm;分生孢子器细胞壁角形组织状,呈黑色或褐色。在器壁的外表面有刚毛束,刚毛长30.8~93.1μm,刚毛近端细基部粗。分生孢子器破碎后可见分生孢子梗,莲藕形,有隔膜,大小50.0~80.0μm×110.0~268.0μm,无分支;分生孢子透明,单胞,圆形或椭圆形,大小0.8~1.5μm×2.3~3.1μm,且内部无滴状斑点。经28srdna序列分析显示,saj-1菌株与丝座壳科(cucurbitariaceae)棘壳孢属(pyrenochaeta)的pyrenochaetaunguis-hominis(gq387621)处于同一最小分支;its基因序列分析,saj-1与pyrenochaetasp.(eu885415)处于同一最小分支。将菌株saj-1的形态学特征与p.unguis-hominis比较发现,菌株saj-1与p.unguis-hominis的分生孢子器及分生孢子的形态及大小较为相似,但分生孢子梗的大小、形态和分支方式,以及菌落在oa培养基上的形态相差较大,且分生孢子内部结构相差较大。根据分子生物学及形态学比较分析判断菌株saj-1属于棘壳孢属pyrenochaetasp.,命名为pyrenochaetasp.saj-1。pyrenochaetasp.saj-1抑菌谱测试结果表明,其对西瓜炭疽病菌(colletrichumlagenarium)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、旋孢腔菌(cochiobolussativus)、大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)、核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)、榆枯萎病菌(ceratocystisulmi)、灰霉病菌(botrytiscinerea)、褐斑病菌(cercosporabeticola)均具有良好的抑制效果。培养特性研究表明,pyrenochaetasp.saj-1在燕麦培养基(oa)、cza和水琼脂培养基(wa)上生长较快,菌株的最适生长温度为25℃,最适光照条件为12光照/12黑暗交替培养。3.拮抗菌pyrenochaetasp.saj-1对桑树种子萌发及桑苗生长的影响pyrenochaetasp.saj-1对桑椹菌核病菌具有很好的拮抗作用,能否利用该菌株在田间防治桑椹菌核病,尚需探究其对桑树生长的影响。故本研究通过温室盆栽实验,研究不同稀释倍数的pyrenochaetasp.saj-1菌株的菌丝体悬液、发酵上清液对桑树种子萌发和幼苗生长的影响。种子萌发研究结果表明,菌丝体100倍和500倍稀释液处理桑树种子时,种子的发芽势和发芽率均高于无菌水处理组,发芽势分别提高40.54%和24.32%,发芽率分别提高23.91%和15.21%,其对桑树种子的萌发具有良好的促进作用。利用saj-1发酵上清液原液、100倍和500倍稀释液处理桑树种子时,种子的发芽势和发芽率均低于无菌水处理组,对桑树种子的萌发具有抑制作用。上清10倍稀释液处理桑树种子时,种子发芽率与无菌水处理组基本一致。pyrenochaetasp.saj-1对桑苗生长影响的研究结果显示:菌丝体原液、10倍、100倍、500倍稀释液均能增加桑苗的根尖数、根鲜重、单株鲜重、地上部分株高和地上部分鲜重。其中以菌丝体10倍稀释液处理效果最好,与无菌水对照组相比,根尖数、主根长、根鲜重、单株鲜重、地上部分株高和地上部分鲜重分别增加50.00%、27.92%、79.87%、112.76%、22.28%、141.71%。发酵上清液原液、10倍、100倍、500倍稀释液能够增加根的鲜重、地上部分株高和地上部分鲜重。其中以上清10倍稀释液处理效果最好,与无菌水处理组相比,主根长、根的鲜重、单株鲜重、叶片长、叶片宽、地上部分株高和地上部分鲜重,分别提高3.33%、139.60%、77.89%、26.45%、52.50%、20.27%、60.30%。进一步研究结果表明,pyrenochaetasp.saj-1菌株能通过产生iaa及溶解磷酸钙而对宿主植物具有促生长作用,定量测定结果显示,saj-1菌株产生iaa的能力随着培养时间的延长先增加,后趋于平稳,且在培养至12天时iaa量达到峰值为13.16μg/ml。saj-1菌株在无机磷平板上可形成直径为24.83mm的透明圈。经测定在发酵至第7天,发酵上清液中磷含量达到最大值447.91μg/ml,继续培养,上清液中的有效磷含量开始减少最后趋于平稳。综上所述,本论文分离研究了桑椹缩小性菌核病病原菌S.shiraiana SXSG-5菌株和桑椹肥大性菌核病病原菌S.sclerotiorum PZ-2菌株。筛选、鉴定了一株对两种桑椹菌核病菌均有拮抗作用的桑树内生菌Pyrenochaeta sp.SAJ-1菌株。该菌株对桑苗生长不仅无负面影响,且对桑树种子的萌发及桑苗生长均具一定的促进作用,本研究取得的结果为桑椹菌核病的生物防治提供了实验材料和研究基础。