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优良的菌种是发酵法生产L-亮氨酸的决定性因素,也是衡量其是否具备工业化价值及发酵成败的关键。本研究根据L-亮氨酸生物合成特点,在选育获得L-亮氨酸的产生菌谷氨酸棒杆菌ML04（Corynebacterium glutamicum ML04）基础上,进一步采用原生质体诱变选育及系统代谢工程育种相结合的方式对L-亮氨酸的生物合成途径、调控系统、分泌系统进行研究,选育获得一株高产L-亮氨酸的工程菌株,结合菌株特性,对发酵配方及工艺控制参数进行了优化,并成功实现了工程菌株工业规模的发酵生产。主要研究结论概括如下:（1）优化了C.glutamicum ML04菌株原生质体制备与再生条件:在含有3.0g/L甘氨酸和5μg/m L氨苄青霉素的培养基中培养细胞至OD562nm为0.5-0.7之间,然后加入终浓度5.0mg/m L的溶菌酶,30℃处理60min,原生质体形成率达到95.2%,再生率达到22.6%。接着对原生质体进行了ARTP诱变及结构类似物的选择,经过高通量初筛和摇瓶复筛获得一株遗传稳定的L-亮氨酸高产菌株ML1-9,摇瓶发酵48h,L-亮氨酸产量达到约15.04g/L,较出发菌株提高70.8%。（2）建立了适用于突变株ML1-9的高效电转化方案:首先在含有3.0g/L的甘氨酸、5μg/m L的氨苄青霉素及1.0g/L的吐温80的培养基培养细胞,弱化细胞壁的合成,增强感受态细胞性能。然后考察了质粒的添加量,以2.5-3.0μg为宜,控制电场强度在0.9-1.0kv/mm,电击结束后立即加入含有0.75mol/L山梨醇的复苏培养基,46℃热激培养8min,进一步钝化细胞修饰系统,热激结束后先37℃预培养1h,然后30℃复苏,涂布低浓度抗生素选择平板,可有效提高外源基因进入C.glutamicum ML1-9细胞的效率。（3）成功构建了系统性代谢修饰菌株MDLeu-19,摇瓶发酵显示其L-亮氨酸合成与积累量显著提高,L-亮氨酸产量最高可达21.8g/L,糖酸的转化率达到27.5%,较对照菌株ML1-9分别提高45.3%和47.3%。而且杂酸比例也显著下降,较出发菌株ML1-9减少了56.1%。（4）克隆和分析了突变株MDLeu-19的α-异丙基苹果酸合成酶（IPMS）及亮氨酸响应的全局调控因子（Lrp）与出发菌株ML04的差异,首次获得特异的氨基酸突变位点,并分别验证了突变对菌株L-亮氨酸合成及分泌的影响。结果显示,IPMS的突变（R529H、G532D及L535V）有利于其与底物的结合,并促进L-亮氨酸的合成,而Lrp的突变（A78G和L80R）能够有效增强其对Brn FE及IPMS正向调控作用,有利于加强L-亮氨酸的合成与分泌。（5）以Ptac启动子为调控元件,串联共表达突变后的IPMS和Lrp,构建了工程菌株MDLeu-19/p Z-leu Ar-lrp*。摇瓶发酵结果显示其L-亮氨酸产量可达约26.7g/L,较对照菌株MDLeu-19提高了22.2%,较初始突变株ML1-9提高77.7%,较原始菌株ML04提高204.6%。（6）创新性的采用小米培养基对工程菌株MDLeu-19/p Z-leu Ar-lrp*进行种子工艺的强化,结合发酵培养基有机氮源及糖控制工艺的改进,大大提高了菌株的发酵水平,30L罐L-亮氨酸产量达42.8g/L,最高葡萄糖转化率达33.2%,分别较原始配方工艺提高20.1%和10.3%,而且杂酸减少,培养基利用率提高,膜通过性好。（7）成功进行了工程菌株C.glutamicum MDLeu-19/p Z-leu Ar-lrp*在60T发酵罐的生产,发酵48h,其L-亮氨酸产量达到40.5g/L,转化率达到30.5%,展示了非常好的工业化规模发酵能力。