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背景原发性肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一。目前,肝癌的分子机制尚不清楚。环状RNA(或circ RNA)是一种单链RNA,与众所周知的线性RNA不同,它形成共价闭合的连续环,即在环状RNA中,通常存在于RNA分子中的3’和5’末端连在一起,此功能赋予环状RNA多种特性。最近,环状RNA(circ RNA)的失调已被证明在癌症发生和发展中具有重要的调节作用。然而,大多数circ RNA在肝细胞癌中的作用仍然未知。目的通过环状RNA表达谱芯片分析肝癌和癌旁组织中的差异环状RNA,并寻找在肝细胞癌发生和发展中有意义的circ RNA,探讨其在HCC发生和发展过程中的具体机制,为HCC的诊断和治疗提供新的思路。方法在本研究中,首先,通过circ RNA Microarray分析了6对肝癌与癌旁组织样本。选取在肝癌组织中表达较高的环状RNA进行验证,并在24对肝癌与癌旁组织样品中通过q PCR进行验证上调的circ RNA。通过RNase R消化法、q PCR鉴定上调的circ RNA为环状RNA。采用Kaplan-Meier统计学方法分析circ RNA与HCC生存预后的关系。其次,通过starbase数据库预测了7个可能与circ-CCT3结合的RBPs。RIP实验用来验证可以与circ RNA结合的RBPs,Me RIP实验用来验证circ RNA的m6A水平。在生物学功能方面,体外实验,通过CCK8和克隆形成检测环状RNA对肝癌细胞增殖的影响,transwell实验用来检测对侵袭和迁移,流式细胞仪检测circ RNA对细胞周期的影响。体内实验,通过裸鼠皮下成瘤和裸鼠肺转移实验分别检测环状RNA对肝癌增殖和迁移的影响。最后,分子机制方面,通过circ RNA免疫沉淀,荧光素酶双报告基因分析,和荧光原位杂交,以评估circ RNA与miRNA之间的相互作用。通过miRanda数据库预测miRNA可能结合的靶基因,采用q PCR和荧光素酶双报告实验验证miRNA所调控的靶基因,并通过CCK8、克隆形成、transwell和流式细胞仪分析靶基因对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移和细胞周期的影响。结果1.circ RNA Microarray分析发现在肝癌组织中有315个环状RNA发生了上调,环状RNA hsa＿circ＿0004680和hsa＿circ＿00014717在肝癌组织中表达较高。通过在24对肝癌组织与癌旁组织分析发现,hsa＿circ＿00014717在癌与癌旁组织间没有差异,而hsa＿circ＿0004680在肝癌组织中高表达,并且命名hsa＿circ＿0004680为circ-CCT3。2.Circ-CCT3可以耐受RNase R的消化,核质分离和荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)发现circ-CCT3主要定位于细胞质中。RNA原位杂交分析发现,circ-CCT3在肝癌组织中高表达,并且circ-CCT3高表达与HCC患者的不良预后相关。3.通过starbase数据库分析可以结合circ-CCT3的RNA结合蛋白,选取了7个是与m6A修饰相关的的RBPs,发现敲低m6A去甲基酶ALKBH5(alk B homolog5,ALKBH5)可以下调circ-CCT3的水平,敲低m6A甲基酶METTL3(methyltransferase‐like3,METTL3)基因可以上调circ-CCT3的水平,通过RIP实验证实ALKBH5和METTL3可以结合circ-CCT3,而me RIP实验说明ALKBH5和METTL3可以影响circ-CCT3的m6A修饰。RIP实验证明m6A读取蛋白YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2,YTHDF2)可以结合circ-CCT3,干扰YTHDF2可以上调circ-CCT3的水平。circ-CCT3在肝细胞癌的生物学功能方面,体内和体外数据表明,敲除circ-CCT3可抑制HCC细胞的增殖,侵袭和迁移。4.通过miRanda数据库预测circ-CCT3可能结合的5个miRNAs,通过circ RIP发现circ-CCT3与miR-378a-3p结合,进一步通过双荧光报告验证了circ-CCT3和miR-378a-3p之间的结合关系,FISH实验证实circ-CCT3和miR-378a-3p之间存在共定位。5.通过miRanda数据库预测miR-378a-3p可能结合的靶基因,挑选了评分>=85的靶基因,通过QPCR发现,过表达miR-378a-3p可以抑制血管内皮生长因子受体1(Vascular endothelial growth factor receptor 1,FLT1)的表达水平,进一步双荧光报告实验证实miR-378a-3p可以与FLT1结合。同时,过表达和干扰circ-CCT3,在RNA和蛋白水平上升高和下降FLT1的水平。拯救实验说明,circ-CCT3可以吸附miR-378a-3p来调控FLT1的表达。6.为了进一步探讨FLT-1在肝细胞癌中的生物学作用,我们通过干扰FLT1基因发现,敲低FLT1可以抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。结论1.与癌旁组织相比,circ-CCT3在肝癌组织中表达升高,并且circ-CCT3高表达与HCC患者的不良预后相关。2.在细胞水平,敲低circ-CCT3可抑制HCC细胞的增殖,侵袭和迁移。在裸鼠动物实验中,干扰circ-CCT3可以抑制裸鼠皮下肿瘤的生长以及降低裸鼠肺转移的能力。3.Circ-CCT3存在m6A修饰,RNA m6A去甲基化酶ALKBH5、m6A甲基化酶METTL3及m6A甲基化识别蛋白YTHDF2参与调控circ-CCT3的表达。4.分子机制上,circ-CCT3可以通过miR-378a-3p/FLT1信号轴促进肝细胞癌的增殖,侵袭和迁移。