肝纤维化(hepatic fibrosis)是与慢性肝脏损伤有关的修复反应过程,是各种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程和必经阶段,其最重要的特征是含有丰富I型胶原蛋白的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成增多,降解减少,这种失衡导致胶原在肝脏组织中过度沉积,部分患者最终发展为肝硬化(liver cirrhosis)、肝癌。目前认为,早期肝纤维化是一可逆的病理过程,然而,肝硬化作为肝纤维化的终末阶段是不可逆转的,因此,如何有效的调控肝纤维化的进展,抑制甚至逆转肝纤维化的进程,是肝纤维化治疗的关键。研究发现,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纤维化发生的始动细胞,是产生ECM的主要细胞来源。HSC持续激活后,其增殖、迁移能力明显增强,并可发生表型转化,成为肌成纤维样细胞(myofibroblast),进而分泌各种细胞因子、趋化因子、ECM等,这些分泌的信号分子可进一步促进HSC细胞的激活,该过程是肝纤维化发生和发展的核心环节,是肝纤维化发生的决定因素。大量研究证实多种细胞信号分子和途径介导HSC纤维化特性的调节,其传导通路极为复杂,并可与多种细胞因子等外部因素共同作用,在慢性肝损伤进展至肝纤维化的病理生理过程中发挥重要作用。然而,其具体的作用机制尚未完全阐明。因此,目前仍需对肝纤维化时HSC持续活化的信号传导通路进行深入研究,以进一步探讨肝纤维化发生及HSC持续活化的分子机制,为肝纤维化防治提供更多有效的干预措施及治疗靶点。近年来,P 物质(substance P,SP)及其受体(NK-1 receptor,NK-1R)介导的神经源性炎症越来越受到重视,SP与其受体结合后,通过激发免疫细胞浸润和细胞因子释放的瀑布式级联反应在疼痛、肝炎、心肌炎、胆汁淤积、菌血症、病毒感染等病理生理过程中发挥重要作用。此外,SP及其受体同样参与了血管的形成、肿瘤细胞的增殖、迁移及影响抗凋亡效应。研究表明,阻断肝脏传入神经或SP受体,可有效降低肝脏损伤的炎症反应,如水肿的形成、粒细胞的浸润、以及抑制肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)的生成,同时,可促进肝细胞保护因子如白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)的合成而抑制肝细胞凋亡、坏死而发挥肝细胞保护作用。由于SP受体阻断剂不仅可以抑制各种炎症因子的释放,还同时具有抗肝细胞凋亡的作用,因此,SP受体阻断剂很有希望成为抑制肝纤维化的潜在药物。我们前期试验研究发现:SP可促进肝脏库普弗细胞(Kupffercells,KCs)表达NK-1R受体,同时促进肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的释放而在小鼠免疫性肝损伤中发挥重要作用。然而,SP是否参与了肝纤维化,尤其是否与HSC激活及持续活化有关,至今仍不清楚。鉴于此,本实验研究了 SP对肝星状细胞活化、增殖及对肝纤维化的影响,并初步探讨其内在作用机制。第一部分:SP对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖、活化及凋亡的影响目的:检测系列浓度的SP在不同的处理时间下对大鼠HSC-T6细胞增殖的影响,同时利用油红染色检测系列浓度SP对HSC-T6细胞活化的影响以筛选出SP最佳作用浓度。在此基础上,应用NK-1R受体阻滞剂(L732138)共处理细胞,并检测SP/NK-1R受体阻滞剂对HSC-T6细胞凋亡的影响,并行western-blot检测HSC-T6细胞活化相关蛋白表达变化,以评估SP/NK-1R受体阻滞剂对肝星状细胞增殖、活化及凋亡的影响。方法:1.使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养HSC-T6细胞,应用系列浓度的 SP(10、50、100、500、1000、5000 nM)分别作用 HSC-T6 细胞 6/12 h,行MTT/LDH检测细胞活性。2.系列浓度的 SP(10、50、100、500、1000、5000 nM)处理 HSC-T6 细胞,行油红染色、western-blot检测HSC活化蛋白α-SMA/Collagen Ⅰ表达变化。3.应用NK-1R受体阻滞剂L732138与SP共培养HSC-T6细胞,行MTT/LDH检测细胞活性,油红染色,western-blot检测α-SMA/CollagenⅠ蛋白水平,评估对HSC-T6活化的影响。4.Hoechst33342/PI双染,流式细胞术检测SP及L732138对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果:1.系列浓度的SP(10-5000 nM)处理细胞6 h,MTT/LDH检测显示各浓度组无明显差异。12h时,500/1000nMSP均可明显升高MTT值并降低LDH的释放。2.油红染色显示500/1000 nMSP可明显促进HSC-T6细胞脱脂滴,western-blot检测示 500/1000 nM SP 促进 α-SMA/Collagen Ⅰ 蛋白表达。3.NK-1R阻滞剂L732138可显著抑制SP对HSC-T6细胞增殖的促进作用,并抑制SP引起的HSC-T6脱脂滴,及α-SMA/Collagen Ⅰ蛋白表达的上调。4.凋亡相关检测显示,500/1000nMSP抑制HSC-T6细胞的凋亡,该作用可被NK-1R受体阻滞剂L732138阻滞。结论:1.较低浓度(10-100nM)的SP在较短作用时间内(6h)对HSC-T6细胞活性无明显影响,500/1000 nM SP作用HSC-T6细胞12 h,可明显促进HSC-T6细胞活性,抑制凋亡并促进HSC-T6细胞活化。2.NK-1R受体阻滞剂L732138可抑制SP对HSC-T6细胞活性、增殖及活化的促进作用,并促进HSC-T6细胞的凋亡,表明在体外实验中,L732138至少可部分抑制SP对肝纤维化的促进作用。第二部分SP在CCl4诱导大鼠肝纤维化模型中的作用目的:应用CC14建立大鼠肝纤维化模型,并同时给予SP受体(NK-1R)阻滞剂L732138 治疗,行 HE/Masson/天狼猩红染色及 western-blot 检测 α-SMA/Collagen I评估SP及L732138对肝纤维化影响,并检测大鼠血清学指标以评估SP及L732138对大鼠肝功能的影响。方法:1.建立CC14大鼠肝纤维化模型:6周龄成年雄性Wistar大鼠(体重:180-220g),于每周二、周五给予50%CCl4橄榄油混合液(1ml/kg)腹腔注射,共6周,每周两次,建立CCl4大鼠肝纤维化模型。2.实验动物分组及药物处理:实验动物共分3批次进行,每批次使用18只Wistar大鼠。18只Wistar大鼠适应性饲养1周后,随机分为三组,每组6只,即正常生理盐水对照组,CC14模型组,CCl4+L732138药物干预组。模型组大鼠处理方式如上。正常生理盐水处理组:给予相同剂量的生理盐水-橄榄油混合液(按照1:1比例混合均匀后使用)。药物干预组于CCl4造模处理前一天(即每周一、周四)给予L732138右下腹腔注射(0.5 mg/kg),共6周,每周两次。于末次给药后24h,将全部大鼠利用10%水合氯醛麻醉,心脏取血并处死,并迅速取出大鼠肝组织,行4%多聚甲醛固定,部分新鲜肝组织-80℃冰箱保存。3.肝组织免疫组织化学染色:测定CCl4模型组SP及NK-1R表达变化。取新鲜肝组织,常规石蜡包埋,切片,抗原修复后,1%BSA封闭,兔抗SP/NK-1R一抗过夜,荧光二抗室温2 h行荧光显色,常规DAPI染液染核,荧光显微镜下观察拍照。4.Wistar大鼠肝脏组织学染色:取4%多聚甲醛固定的肝组织,石蜡包埋。常规5 μm厚石蜡切片,行苏木素伊红(HE)染色,光镜下观察肝组织纤维化程度及炎症浸润程度。Masson及天狼猩红染色进一步观察不同处理组胶原沉积情况。5.Western-blot检测肝纤维化相关蛋白α-SMA/Collagen I表达水平,评估各组肝纤维程度。6.测定肝组织羟脯氨酸含量:取新鲜的4%多聚甲醛固定的肝组织,匀浆器研磨,6 N盐酸水解过夜后,10 N浓NaOH中和,分别经枸橼酸、氯胺T及过氯酸处理后,最后加入ehrlich试剂65℃处理20 min,酶标仪测定570 nm处吸光度值,根据羟脯氨酸标准品绘制标准曲线,据此计算出各检测样本的羟脯氨酸的含量,进一步评估各处理组肝纤维程度。7.血清生化检测:测定各组大鼠血清ALT/AST水平。取各组大鼠新鲜血浆,离心后收集上清,根据ALT/AST检测试剂盒说明,检测各实验组ALT/AST水平,以评估各组大鼠肝损伤程度。结果:1.免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,CCl4肝纤维化模型鼠肝组织SP及NK-1R表达明显升高。2.HE染色结果显示,正常对照组大鼠肝脏无明显的病理变化。CCl4模型组大鼠可见肝脏发生大量的空泡样变,部分肝细胞坏死;另有大量的炎性细胞浸润及纤维间隔形成。L732138可在一定程度上抑制CCl4介导的肝纤维样变,该组大鼠肝组织炎性浸润细胞减少,纤维间隔同样较少。Masson/天狼猩红染色显示,模型组大鼠可见大量的纤维间隔形成,L732138可减轻模型组肝纤维化程度。3.Western-blot检测结.果显示,CCl4模型组大鼠肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ表达水平较正常对照组明显升高;与模型组相比,L732138干预处理后可显著降低肝组织a-SMA/Collagen I蛋白表达水平,但仍高于正常对照组。4.肝组织羟脯氨酸检测结果显示,模型组羟脯氨酸含量较正常对照组明显升高,而L732138治疗组较模型组明显降低,但仍高于正常对照组。5.血清生化学检测显示模型组ALT/AST显著升高,L732138可在一定程度降低二者水平。结论:1.CCl4大鼠肝纤维化模型中,肝组织SP及NK-1R蛋白表达水平明显升高。2.NK-1R受体阻滞剂L732138可在一定程度上减轻肝损伤,降低肝纤维化程度,发挥抗肝纤维化作用。第三部分SP影响肝星状细胞增殖/活化及肝纤维化的机制研究目的:初步探讨SP影响HSC活化及肝纤维化的内在机制,为肝纤维化的治疗提供理论基础。方法:1.为排除细胞种属对实验结果的影响,本实验同时在大鼠肝星状细胞系HSC-T6及人肝星状细胞系LX2中进行,不同药物处理后,提取细胞总蛋白行western-blot检测,观察SP及NK-1R受体阻滞剂对肝纤维化密切相关信号通路TGFβ1/Smad-3蛋白表达的影响。2.为进一步验证SP影响肝星状细胞活化及肝纤维化是否通过TGFβ1/Smad-3信号通路,我们应用TGFβ1受体抑制剂SB431542处理细胞,并行MTT/LDH检测细胞活性,油红染色检测细胞活化情况,western-blot检测肝纤维化相关蛋白α-SMA/Collagen I表达水平。3.为排除单一药物本身对肝星状细胞活化及肝纤维化的影响,我们利用另一种NK-1R受体阻滞剂RP67580处理细胞,MTT/LDH检测其对细胞增殖,western-blot检测其对肝纤维化相关蛋白α-SMA/Collagen I的影响。4.动物模型中检测内质网应激相关蛋白Caspase-12表达变化。结果:1.Western-blot结果显示,500 nM及1000 nM SP可明显促进HSC-T6细胞及LX2细胞中TGF-β1,p-Smad-3蛋白表达;NK-1R受体抑制剂L732138可显著抑制两种细胞系中SP对TGFβ1/Smad-3信号通路的上调作用。2.油红染色结果显示,与1000 nM SP组相比,应用TGFβ1抑制剂SB431542处理细胞可明显抑制HSC-T6细胞脱脂滴,即抑制细胞的活化;MTT/LDH检测结果表明SB431542可抑制细胞的增殖,并降低肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenⅠ的表达。但与L732138处理组相比,差异有统计学意义,说明L732138抑制细胞增殖/活化及肝纤维化的机制不完全通过TGFβ1/Srmad-3 信号通路。3.与L732138对肝星状细胞增殖活化的影响一致,另一种NK-1R受体阻滞剂RP67580同样可抑制SP对肝星状细胞增殖活化的促进作用,并抑制肝纤维化相关蛋白α-SMA/CollagenI的表达。4.动物模型中蛋白表达水平检测结果显示,L732138可抑制肝脏Caspase-12蛋白的表达,说明L732138可通过抑制肝脏的内质网应激来抑制肝纤维化,而不仅仅是通过TGFβ1/Smad-3信号通路。结论:1.SP通过TGFβ1/Smad-3信号通路促进肝星状细胞增殖活化及肝纤维化。2.L732138抑制肝星状细胞增殖/活化及肝纤维化的机制不完全通过TGFβ1/Smad-3 信号通路。3.L732138可通过抑制肝脏的内质网应激来抑制肝纤维化。