研究背景与实验目的近年的临床研究发现,胰岛素除用于控制血糖,还可用于治疗严重烧伤、脓毒血症、感染性休克等危重疾病,改善病人症状,降低病人死亡率,但其作用机制并不清楚。进一步研究发现,胰岛素可减轻烧伤或脓毒血症大鼠系统性的炎症反应。对于急性心肌梗死(AMI)患者,静脉注射胰岛素可降低血浆中C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)的水平。这些结果均提示胰岛素具有显著的抗炎作用。另一方面,炎症反应是造成心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的重要机制之一。肿瘤坏死因子(TNF)-α是在MI/R早期产生的一种重要的促炎细胞因子,它不仅能够诱导其他炎性细胞因子的增加,而且还可促进细胞粘附分子的表达,进一步引起中性粒细胞在心肌组织的浸润以及心脏功能的衰竭。大量临床试验表明AMI、脓毒血症及心衰等疾病中TNF-α的增加均可导致心肌细胞死亡和功能异常。联系以上两个方面我们思考:胰岛素治疗是否能抑制炎性细胞因子如TNF-α的生成,减轻MI/R病理过程中的炎症反应?如果是,胰岛素抗炎作用的具体机制是什么?我们的前期研究发现,胰岛素可通过PI3K-Akt信号转导通路激活心肌内源性eNOS-NO系统。已知NO具有一定的抗炎特性,在多种生理病理状态下可帮助调节组织器官的血流并保持血管内皮细胞和炎症细胞的协调性。越来越多的临床试验提示eNOS-NO信号系统在AMI及其他炎症相关疾病的病理过程中具有重要作用。但是,胰岛素是否通过诱导心肌内源性NO生成在MI/R病理过程中发挥抗炎作用,尚需进一步深入研究。因此,本研究的实验目的是:1.明确胰岛素治疗能否抑制炎性细胞因子(尤其是TNF-α)的产生,减轻MI/R病理损伤过程中的炎症反应,从而发挥抗炎作用。2.如果是,进一步探讨胰岛素抗炎作用的具体信号转导机制,尤其是Akt、eNOS等信号分子在其中的作用。3.研究胰岛素的上述抗炎效应是否最终有助于保护缺血心肌。实验方法1.整体动物实验:Sprague-Dawley雄性大鼠,常规制备大鼠急性MI/R(30 min/3 h)模型。将动物随机分为四组,每组8只。①假手术组(Sham MI/R):开胸,但不结扎冠状动脉;②生理盐水组(MI/R+V);③葡萄糖-胰岛素-钾(GIK)组(MI/R+GIK):250 g/L葡萄糖+60 U/L胰岛素+80 mmol/L KCl;④GK组(MI/R+GK):250 g/L葡萄糖+80 mmol/L KCl。上述液体分别以4 ml/kg/h速度于再灌注前5 min开始输注并持续到再灌注结束。2.再灌注3 h结束后,利用血糖仪检测血糖变化,放免法测定血浆胰岛素水平。采用伊文氏兰-TTC双染法测定心肌梗死面积,以梗死面积(INF)占缺血区面积(AAR)的百分比表示(INF/AAR×100%)。3.再灌注结束后处死动物,收集血液,分离血清,分光光度法检测血清肌酸激酶(CK)活性,利用ELISA试剂盒检测血清TNF-α和IL-10的含量;同时留取心肌组织,分光光度法检测心肌髓过氧化物酶(MPO)活性,ELISA试剂盒检测心肌TNF-α的含量。4.离体实验:原代分离培养乳鼠心肌细胞,给予模拟缺血/再灌注(SI/R,2 h/4 h)处理,再灌注时随机分为以下几组(n=8):①Vehicle(无酚红DMEM);②胰岛素(10-7 mol/L);③胰岛素+PI3K特异性抑制剂wortmannin(10 nmol/L);④胰岛素+eNOS抑制剂L-NAME(100μmol/L);⑤中和性抗TNF-α抗体(Neutralizing anti-TNF-αIgG)或者Nonimmune IgG(5μg/ml);⑥胰岛素+中和性抗TNF-α抗体(5μg/ml)。5.再灌注结束后,台盼蓝染色检测心肌细胞活性,Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测细胞凋亡率, Western Blot测定心肌细胞Akt、eNOS表达和磷酸化水平的变化。同时收集细胞培养上清,利用ELISA试剂盒测定TNF-α含量,特异性NO检测试剂盒测定NOX含量。实验结果1.与生理盐水组相比,GK组大鼠血糖显著升高(P<0.01),GIK组血糖无明显变化;与生理盐水组相比,GIK(P<0.01)和GK(P<0.05)组血浆胰岛素水平均升高(n=8)。2.心肌缺血30 min再灌注3 h导致大鼠血清促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子IL-10水平明显升高(与假手术组相比,P均<0.01,n=8)。与生理盐水组相比,再灌注时给予GIK显著降低血清TNF-α水平,同时促进IL-10水平进一步升高;而GK组与生理盐水组相比无明显差别,提示胰岛素可减轻MI/R大鼠系统性的炎症反应。3.与假手术组相比,缺血30 min再灌注3 h导致心肌组织中TNF-α生成大量增加、MPO活性(反映中性粒细胞的浸润水平)显著升高。与生理盐水组相比,再灌注时给予GIK而非GK显著减少心肌TNF-α生成(19.73±1.45 pg/mg protein,与生理盐水组28.31±2.31 pg/mg protein相比, P<0.01,n=8),进而降低心肌MPO活性(与生理盐水组相比,P<0.01,n=8)。这些结果提示再灌注时给予胰岛素可抑制中性粒细胞在缺血/再灌注心肌的浸润,减轻心肌组织局部的炎症反应。4.与假手术组相比,MI/R大鼠心肌梗死面积和血清CK活性均明显增加。再灌注时给予GIK显著降低心肌梗死面积(37.6±2.2%,与生理盐水组49.5±2.8%相比,P<0.05,n=8)和血清CK活性(P<0.01,n=8);而仅给予GK则对大鼠心肌梗死面积和血清CK活性均无明显影响,提示再灌注时给予胰岛素可明显减轻缺血/再灌注心肌损伤。5.与正常培养状态相比,缺血2 h再灌注4 h导致心肌细胞TNF-α生成大量增加。再灌注时给予胰岛素可显著降低TNF-α生成(9.04±1.01 pg/106 cells,与Vehicle组16.31±1.44 pg/106 cells相比,P<0.01, n=8),同时使心肌细胞Akt和eNOS的磷酸化水平分别升高2.6倍和2.1倍、NO生成明显增加(P<0.01);胰岛素的上述作用可被wortmannin或L-NAME阻断。这些结果提示胰岛素可通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路,促进NO生成,进而抑制缺血/再灌注心肌细胞TNF-α产生。6.缺血2 h再灌注4 h导致心肌细胞存活率降低,凋亡率增加。再灌注时给予胰岛素或中和性抗TNF-α抗体均能显著提高心肌细胞存活率(分别为76.6±2.1%、67.5±2.4%,与Vehicle组相比,P均<0.01,n=8),降低细胞凋亡率(分别为20.5±1.2%、28.0±1.3%,与Vehicle组相比,P均<0.01,n=3);与单独胰岛素作用相比,中和性抗TNF-α抗体与胰岛素的联合应用并不能进一步地改变心肌细胞的存活率和凋亡率(P均>0.05)。这些结果表明胰岛素可通过抑制TNF-α生成,促进心肌细胞存活、抑制心肌细胞凋亡,保护缺血心肌。结论胰岛素可通过激活PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路,减少缺血/再灌注心肌TNF-α生成,抑制心肌中性粒细胞的浸润,减轻心肌损伤,保护缺血心肌。上述结果提示胰岛素心血管保护的抗炎新机制,为胰岛素更有效、合理应用于治疗AMI及其他危重疾病提供了理论依据和参考资料。