代谢抑制剂对海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的影响

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为研究代谢抑制剂对海南粗榧(Cephalotaxus mannii)悬浮细胞生长及三尖杉酯类碱合成的影响。本文选取海南粗榧细胞产物合成途径中初生代谢途径代谢抑制剂氟化钠(NaF),L-丙氨酸及其衍生物L-环己基丙氨酸(L-cyclohexylalanine, L-CHA)和D-丙氨酸,以及产物三尖杉酯类碱合成支路代谢抑制剂L-色氨酸及其衍生物5-甲基-DL-色氨酸(5-Methyl-DL-tryptophan,5-MT),通过单独作用及联合使用,在海南粗榧悬浮细胞培养的不同阶段,分别添加不同剂量的上述代谢抑制剂,测定细胞生物量、细胞活力、培养基糖耗以及产物含量,确定最佳添加剂量及添加时间。并且,为研究其作用机理,对一些关键酶活力和代谢途径中的中间代谢物含量进行了测定,结果如下。在不同培养时期添加不同浓度的代谢抑制剂后,对细胞生长和细胞活力均会产生抑制作用,其抑制作用强度与添加时间成反比,与添加剂量成正比。在15d添加15mg/L NaF可获得最佳产量。NaF能有效提高磷酸戊糖途径(Hexose monophosphate pathway, HMP途径)的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6DPH)的活性。在15 d添加30 mg/L L-丙氨酸,10 mg/L L-环己基丙氨酸,10 mg/L D-丙氨酸后,三尖杉酯类碱产量分别最高;其中添加L-环己基丙氨酸对产物的促进作用大于D-丙氨酸大于L-丙氨酸。L-丙氨酸及其衍生物能有效抑制糖酵解途径(Enbden-Meyerhof-Parnas, EMP途径)中丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)活力,抑制磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸,同时提高HMP途径的关键酶G6PDH的活性。在15d添加10 mg/L L-色氨酸和5 mg/L5-MT后,三尖杉酯类碱产量分别最高;5-MT对产物的促进作用大于L-色氨酸,L-色氨酸及其衍生物对产物合成代谢支路色氨酸产生途径有反馈抑制作用。同时,苯丙烷类途径中苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性与产物酚类物质分别比对照增加。最后,在最佳添加时间第15 d复合添加10 mg/L NaF和3 mg/L 5-MT以及5 mg/LL-环己基丙氨酸和3 mg/L 5-MT,复合添加代谢调节剂对细胞生物量和细胞活力的影响较单独添加小,对产物三尖杉酯类碱合成的促进作用更明显,同时添加5 mg/L L-环己基丙氨酸和3 mg/L 5-甲基-DL-色氨酸时,三尖杉酯类碱总含量最高。
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