论文部分内容阅读
目的：研究缓释降钙素基因相关肽(CGRP)的壳聚糖涂层掺锶磷酸钙骨水泥(CGRP/Chitosan-Sr-CPC)的合成方法、形态结构、力学性能、释放规律,及其对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。方法：(1)材料分组与制备：实验分3组,CGRP/Chitosan-Sr-CPC为实验组,掺锶磷酸钙骨水泥(Sr-CPC)(锶和钙的摩尔比是1：9)、壳聚糖涂层掺锶磷酸钙骨水泥(Chitosan-Sr-CPC)为对照组。根据文献方法制备Sr-CPC[1-2], Sr-CPC作为多孔基体,采用加压渗透和冷冻干燥法,吸附CGRP进入孔隙内,然后再采用加压渗透和冷冻干燥法,表面吸附壳聚糖(Chitosan)涂层,合成CGRP/Chitosan-Sr-CPC和Chitosan-Sr-CPC(未吸附CGRP)。(2)材料表征：扫描电镜(SEM)、微计算机断层扫描(micro-CT)、电子动静态万能材料试验机观察分析材料的表面结构、孔隙和力学性能,ELISA试剂盒检测探究模拟体液(SBF)中材料CGRP的释放规律。(3)细胞实验：免疫荧光法(IF)检测观察原代人脐静脉血管内皮细胞(]HUVECs)表面CGI RP受体表达的情况,骨架染色观察材料表面的细胞粘附形态,CCK8法评估材料细胞毒性和刺激增殖能力, ELISA试剂盒检测细胞分泌内皮细胞生长因子(VEGF)的水平。结果：成功合成CGRP/Chitosan-Sr-CP C。材料表征：SEM镜下观察其表面均匀铺展一层Chitosan涂层,在SBF中第7天仍然存在。其中Sr-CPC基体在SBF中表面逐渐生成花丛样、针尖样物质(根据以往实验和文献资料,该物质为羟基磷灰石晶体)[1-2]。micro-CT检测孔隙率为(4.06±1.19)%,孔径多分布于45-82μm区间。与Sr-CPC相比,早期无明显抗压强度损失,且随时间逐步增加。ELISA试剂盒检测结果显示CGRP可持续释放至第5天,释放速率随时间逐渐减慢。细胞实验：IF镜下观察HUVECs表达CGRP受体。从骨架染色图片可看出细胞在材料表面良好粘附。CCK8实验结果说明,各组材料溶出物无细胞毒性,实验组细胞增殖率明显高于对照组(P<0.05)。ELISA试剂盒检测第2天培养液中细胞分泌VEGF水平,实验组较对照组明显升高(P<0.05)。结论：通过上述实验方法合成的CGRP/Chitosan-Sr-CPC复合骨水泥,生物相容性良好,结构性能与Sr-CPC相比无明显差异,同时体外早期可以持续释放微量活性CGRP神经肽,与细胞CGRP受体特异性结合,可能通过上调内皮细胞表达和分泌VEGF,进而刺激内皮细胞增殖。期望其在血供环境差的骨损伤(如老年性骨质疏松性骨缺损)修复中,通过早期持续释放微量活性CGRP神经肽,改善骨水泥与组织交互界面的神经营养环境,刺激内皮细胞增殖和血管生成,构建良好微循环,增强Sr-CPC的骨整合、骨诱导能力,拓展应用范围。