目的:急性髓细胞白血病是起源于造血干/祖细胞的一组血液系统恶性疾病,表现为白血病细胞的过度增殖、凋亡抑制及分化受阻。目前,急性髓细胞白血病在诊断及治疗方面取得了一定的进展,以化疗为基础的综合治疗,尤其是二代测序技术和异基因造血干细胞移植技术的发展大大的提高了患者的诊治深度和生存情况。随着细胞遗传学及分子生物学研究的不断深入,白血病的发病机制得到了更深入的研究,更多的基因在白血病中的作用得到了阐释,为白血病的疾病预警、预后分析及靶向治疗提供了更多潜在的可能。N-乙酰基转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是GCN5相关N端乙酰基转移酶(GCN5-related N-acetyltransferase,GANT)家族成员,最早是在人端粒酶逆转录酶hTERT的启动子区被发现的。随后的研究发现NAT10具有抵抗DNA损伤、组蛋白乙酰化、核糖体RNA乙酰化及微管乙酰化修饰作用,并能够稳定细胞核结构和调控细胞周期。研究证实NAT10在肝癌、结直肠癌及黑色素瘤等肿瘤细胞中具有促癌作用,与不良预后相关,但目前NAT10在白血病中的表达及作用尚未见相关报道。通过生物信息学网站分析我们发现NAT10在急性髓细胞白血病细胞中也存在高表达,通过GO及KEGG数据库分析与其可能存在相互作用的蛋白的相关通路我们发现NAT10可能与端粒酶长度维持、细胞周期调控、RNA合成装配及髓细胞分化调节相关。根据上述发现,我们设计了一系列实验检测NAT10在急性髓细胞白血病患者骨髓中的表达水平并分析其以患者各项指标、首次化疗效果及预后的关系,探索NAT10在急性髓细胞白血病细胞增殖、凋亡及周期中的作用及其相关作用机制,希望能为急性髓细胞白血病的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:1、收集48例急性髓细胞白血病患者及20例非恶性血液疾病患者或健康人的骨髓液,提取骨髓单个核细胞,其中非M3型40例,M3型(急性早幼粒细胞白血病)8例,应用实时荧光定量PCR法检测骨髓单个核细胞中NAT10的mRNA表达水平。收集患者入院时的各项常规检查结果、骨髓象检测结果、分子生物学及细胞遗传学检测结果,收集患者诱导化疗疗效及生存情况,分析NAT10表达水平对AML患者临床指标、化疗效果及生存的影响。同时以髓系白血病细胞系HL-60、NB4、K562、KG1α及U937为研究对象,检测各个细胞系NAT10 m RNA的表达水平;用免疫荧光法检测NAT10在AML细胞中的表达定位。2、根据上部分实验筛选出的高表达NAT10的细胞系,应用NAT10特异性抑制剂Remodelin下调NAT10表达,通过实时荧光定量PCR和western blot验证NAT10的表达水平变化以证实Remodelin的效用;应用CCK-8法检测NAT10对急性髓细胞白血病细胞增殖活性的影响;应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测Remodelin单药或联合caspase抑制剂Z-VAD-FMK对急性髓细胞白血病细胞凋亡的影响;应用western blot方法检测caspase 3、cleaved caspase 3、caspase 7、caspase 9、Bcl-2、BAX以及BAK蛋白的表达水平;应用PI染色流式细胞术检测NAT10对AML细胞周期的影响,并应用western blot法测定细胞周期调控因子p21、cyclin D1、cyclin E、CDK2及CDK4蛋白的表达来探究周期调控机制。3、应用罗丹明123染色流式细胞术检测Remodelin对AML细胞线粒体膜电位的影响;应用western blot检测内质网应激相关蛋白GRP78、PERK、eIF2α、caspase 12、cleaved caspase 12及CHOP的表达探究内质网应激在NAT10介导的细胞凋亡中的作用;Remodelin处理AML后用western blot法检测PI3K、Akt及p-Akt的表达水平,并应用Remodelin联合PI3K激活剂IGF-1和PI3K抑制剂LY294002来探究PI3K/Akt通路在NAT10介导的AML细胞凋亡中的作用。4、用间接免疫荧光法检测NAT10与NPM1的表达定位;分别提取总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白,western blot法检测下调NAT10后NAT10与NPM1的总体表达及在胞浆和胞核的表达水平。结果:1、在急性髓细胞白血病患者中的NAT10 mRNA表达水平明显高于非恶性血液病者(P<0.01)。由于急性早幼粒细胞白血病患者预后良好,我们单独分析了40例非M3型AML患者的临床资料。我们以初治AML患者的NAT10 m RNA相对表达量的中位值为分界,将AML患者分为NAT10高表达组及低表达组,结果显示,高表达组和低表达组的患者性别、年龄、FAB分型及危险分层没有差异。40例AML患者中25例接受了诱导化疗,其中14例完全缓解,1例部分缓解,10例未缓解,高低表达NAT10患者的首次诱导化疗缓解率没有差异,但未缓解组患者NAT10的相对表达量高于总体缓解组患者。患者中位随访时间为5.5个月,NAT10低表达的患者总体生存期和无进展生存期长于高表达患者。同时检测急性髓细胞白血病细胞系NB4、HL-60、KG1α、K562及U937中NAT10 mRNA的表达,发现NB4及U937细胞系NAT10的表达量明显高于其他细胞系,遂后续实验我们选用NB4及U937两种细胞系。免疫荧光结果显示,NAT10在NB4及U937细胞中均表达于细胞核。2、NAT10抑制剂Remodelin可在mRNA及蛋白水平使NAT10表达下调。CCK-8法检测发现Remodelin下调NAT10后可降低AML细胞的增殖活力,且抑制作用呈时间-剂量依赖性。用不同浓度的Remodelin处理NB4及U937细胞24小时后用Annexin V-FITC/PI流式细胞术来检测细胞凋亡率,结果显示下调NAT10可以促使NB4及U937细胞发生凋亡。用caspase抑制剂Z-VAD-FMK联合Remodelin处理细胞的凋亡率较Remodelin单药的凋亡率有明显降低,进一步说明细胞发生了caspase依赖的凋亡。应用western blot方法检测发现caspase 3、caspase 7及caspase9下调,cleaved caspase 3的表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,凋亡蛋白BAX及BAK表达量上调,说明线粒体凋亡途径参与了NAT10介导的细胞凋亡。采用流式细胞术检测Remodelin下调NAT10后对NB4及U937细胞周期分布的影响,结果显示G1期细胞比例较对照组明显增多,说明下调NAT10可使NB4及U937细胞发生G1期阻滞;western blot方法检测了周期调控相关蛋白的表达量,结果显示,下调NAT10能使p21表达增加,cyclin D1、cyclin E、CDK2以及CDK4的表达减少。3、罗丹明123染色流式细胞术检测发现Remodelin处理后NB4及U937细胞的荧光值下降,表明下调NAT10后AML细胞的线粒体膜电位下降,说明下调NAT10能够激活线粒体凋亡途径。接下来,我们探究了内质网应激途径是否参与了NAT10介导的细胞凋亡,结果显示,Remodelin处理后细胞GRP78、PERK、eIF2α、caspase 12、cleaved caspase 12及CHOP蛋白表达均增加,说明内质网应激途径参与了NAT10诱导的细胞凋亡。鉴于我们前步发现NAT10对细胞凋亡和周期的作用,我们探究了PI3K/Akt通路是否参与了NAT10介导的凋亡和周期调控,我们接下来检测了Remodelin处理后PI3K、Akt及p-Akt的表达变化。Western blot结果检测显示药物处理后NB4及U937细胞PI3K、Akt及磷酸化Akt蛋白的表达量下降,且呈剂量依赖性。为了进一步验证NAT10在PI3K/Akt通路中作用,我们用Remodelin联合PI3K抑制剂LY294002或激活剂IGF-1处理细胞。我们设置Remodelin单药组、Remodelin+IGF-1组及Remodelin+LY294002组,流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示凋亡率Remodelin+LY294002组高于Remodelin单药组高于Remodelin+IGF-1组,且PI3K、Akt及p-Akt蛋白水平从高至低依次是Remodelin+IGF-1组、Remodelin单药组及Remodelin+LY294002组,说明Remodelin通过抑制PI3K/Akt信号通路促进AML细胞凋亡。4、用间接免疫荧光法检测NAT10与NPM1的表达共定位,结果显示NAT10与NPM1共定位于细胞核。Western blot法检测下调NAT10后NAT10与NPM1在胞浆和胞核的表达水平。结果显示,Remodelin处理后细胞核及细胞浆内NAT10的表达均下调,NPM1在U937细胞浆内的表达下调,但细胞核内的表达上升,在NB4细胞的胞核及胞浆中表达均下调,总体表达量两种细胞系均下降,说明下调NAT10能够下调NPM1的表达,且可能促进NPM1由细胞浆向细胞核转移。结论:1、NAT10在急性髓细胞白血病患者中的表达较正常对照组有明显上调,且高表达NAT10 mRNA预示着更低的缓解率和更短的生存期。2、下调NAT10可以抑制急髓白血病细胞的增殖,促进其发生caspase依赖的凋亡,并使其发生G1期阻滞。3、下调NAT10能够下调线粒体膜电位,同时能够通过激活内质网应激途径促进细胞凋亡;下调NAT10通过抑制PI3K/Akt信号通路促进细胞凋亡。4、NAT10与NPM1共定位于细胞核,下调NAT10能够抑制NPM1的表达,促进NPM1从细胞浆向细胞核转移。