【摘 要】
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目的:肿瘤新抗原多为弱免疫原性,其新抗原肽不能诱发有效免疫反应,活化的T细胞杀伤活性越强的抗原肽的免疫原性越强。本研究通过二代测序结肠癌等肿瘤患者标本的全外显子测序,运用生物信息学分析确定外显子突变基因,预测HLA-Ⅰ类分子递呈的新抗原肽并合成,确定其来源的基因的突变方式、HLA-Ⅰ等位基因及其产物的结合亲和力,并合成新抗原肽,通过免疫学实验检测肿瘤新抗原肽的免疫原性,以此阐明新抗原肽的突变相关情
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目的:肿瘤新抗原多为弱免疫原性,其新抗原肽不能诱发有效免疫反应,活化的T细胞杀伤活性越强的抗原肽的免疫原性越强。本研究通过二代测序结肠癌等肿瘤患者标本的全外显子测序,运用生物信息学分析确定外显子突变基因,预测HLA-Ⅰ类分子递呈的新抗原肽并合成,确定其来源的基因的突变方式、HLA-Ⅰ等位基因及其产物的结合亲和力,并合成新抗原肽,通过免疫学实验检测肿瘤新抗原肽的免疫原性,以此阐明新抗原肽的突变相关情况和新抗原肽的临床免疫效应的关系,为快速发现有效的新抗原肽进而构建高效瘤苗提供依据。方法:二代测序技术全外显子测序11例结肠癌等肿瘤患者的肿瘤样本,获取每个肿瘤标本的全外显子基因组数据;运用生物信息学分析并通过NetMHCpan4.0等软件确定外显子突变基因,筛选HLA-Ⅰ类分子递呈的8-11氨基酸残基新抗原肽及其来源的基因的突变方式、HLA-Ⅰ等位基因、与HLA-Ⅰ等位基因产物的结合亲和力,并人工合成新抗原肽。这些肿瘤患者抽取新鲜外周血（PBMC）,分离外周血单个核细胞,诱导分化未成熟树突状细胞（DC）制备新抗原肽活化的DC混合淋巴细胞与PBMC共培养得到活化的T淋巴细胞;通过酶联斑点技术（ELISPOT试验）检测新抗原肽活化的T效应淋巴细胞的杀伤活性;通过流式细胞技术鉴定新抗原肽活化的T效应淋巴细胞（CD8+T淋巴细胞）等各免疫细胞的比例。按3因素4水平正交设计试验,使用L16（34）表。结果:第一部分:新抗原肽突变相关特性1、预测筛选了 645条新抗原肽,明确了新抗原肽各种特征性信息。2、每个患者递呈Ⅰ类抗原的HLA等位基因产物一般3-6型,统计11例患者中每种HLA分型的频数及百分比如图2所示,我们发现以HLA-A*02:01为主。3、统计11例患者共测得645条Ⅰ类新抗原多肽,我们发现新抗原多肽长度以9肽为主。4、由全外显子测序可获得每种新抗原多肽与HLA分子结合亲和力（图4）,本研究发现645条新抗原多肽的亲和力多在1-2之间。5、新抗原多肽中以单氨基酸替换突变为主,约占94.3%,其中单氨基酸又以极性氨基酸突变至极性氨基酸为主。第二部分:新抗原肽诱导的T效应淋巴细胞活性正交实验L16（34）,以ELISPOT检测各肽的T细胞活化数量,量化各肽免疫原性,经统计分析得出:对新抗原肽免疫原性的影响依次为氨基酸突变方式>HLA亲和力变化度>新抗原肽长度,且亲和力变化度在1-2的极性突变为非极性的新抗原九肽:ELISPOT值最高,CD8+T数最多。结论:1、在新抗原的氨基酸残基突变中,九肽为主,递呈新抗原肽的等位基因产物以HLA-A*02:01为主,亲和力变化度1-2较多,极性突变为极性的单氨基酸替换突变为最常见,多氨基酸残基突变极少。2、亲和力变化度在1-2的极性突变为非极性的新抗原九肽:ELISPOT值最高,CD8+T数最多。3、在3个因素中以突变方式的影响性最重要,由极性氨基酸残基突变为非极性氨基酸的突变类型,免疫原性增最强。4、采用二代测序技术发现新抗原特性,基于新抗原多肽氨基酸残基长度、氨基酸突变及HLA亲和力变化度这3个因素可建立快速简捷筛选免疫活性较强的新抗原的新方法。
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