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目的:本实验通过比较不同浓度地塞米松对骨髓细胞的影响,观察骨髓细胞对急性肺损伤的治疗作用,探讨地塞米松的适宜浓度。 方法:1、体外实验:正常骨髓组:取正常荧光小鼠的骨髓细胞,分成5组,每组骨髓细胞数为5×106个。其中的4组分别加入地塞米松2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、1ug/ml,第5组不加地塞米松为对照组。各组加细胞完全培养基至1ml,放入培养箱中培养24h后离心,重悬。将得到的各正常骨髓细胞放入经过LPS刺激的正常健康的C57BL/6小鼠的肺组织细胞(每组细胞数为5×106个)中,各组培养48h后分别在倒置相差显微镜下记录细胞形态,并加入抗体和7-AAD试剂通过流式细胞仪检测肺组织细胞的凋亡率。脓毒症骨髓组:取盲肠结扎穿孔法得到的脓毒症荧光小鼠的骨髓细胞,分组及处理同正常骨髓组。各组加细胞完全培养基至1ml,放入培养箱中培养24h后离心,重悬。将得到的各毒症骨髓细胞放入经过LPS刺激的正常健康的C57BL/6小鼠的肺组织细胞(每组细胞数为5×106个)中,各组培养48h后的处理同正常骨髓组。单纯对照组1组:不加入骨髓细胞的单纯肺组织细胞组(肺组织细胞107个),培养48h后的处理同正常骨髓组。2、体内实验:共11组,其中正常骨髓组5组:回输未经地塞米松处理的正常骨髓细胞和经过不同浓度地塞米松(2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、1ug/ml)处理的正常骨髓细胞(每组细胞数为5×106个)组。脓毒症骨髓组5组:回输未经地塞米松处理的脓毒症骨髓细胞和经过不同浓度地塞米松(2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、1ug/ml)处理的脓毒症骨髓细胞(每组细胞数为5×106个)。单纯对照组1组:回输生理盐水。各个实验组均通过腹腔注射的方法回输入正常C57BL/6小鼠的体内,24h后处死小鼠,取出肺组织,研磨,离心,重悬后分别在倒置相差显微镜下记录细胞形态、数量和荧光性,并加入抗体和7-AAD试剂,通过流式细胞仪检测肺组织细胞的凋亡率。3、死亡率实验:取正常C57BL/6小鼠220只,每组20只,共11组,分别通过LPS滴鼻方法制成急性肺损伤模型,其中5组回输经过不同浓度地塞米松(0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、1ug/ml)处理的正常荧光骨髓细胞(每组细胞数为5×106个),5组回输经过不同浓度地塞米松(0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、1ug/ml)处理的脓毒症荧光骨髓细胞(每组细胞数为5×106个)。对照组1组,回输生理盐水。禁食,不禁水继续饲养48h后观察死亡率。 结果:1、体外实验中:可见细胞的数量及形态均发生改变,在正常骨髓组通过对比发现,各个实验组与单纯肺组织细胞组相比数量都多,并且经过地塞米松2ng/ml处理的实验组细胞数量最多,视野内可以发现组织团块。而其他各个实验组细胞数量基本相同,并且没有发现组织团。脓毒症骨髓组通过对比发现,各个脓毒症实验组细胞数量与单纯肺组织细胞组相比都较少,而且细胞形态较差,细胞碎片较多。各个脓毒症实验组之间对比,细胞形态和细胞数量基本相同。将各组细胞经流式仪检测凋亡率可以发现,各个正常骨髓细胞组的凋亡率均较脓毒症实验组的凋亡率低(P<0.05)。与单纯肺组织对照组相比,未经过地塞米松处理的正常骨髓组和经过2ng/ml地塞米松处理的正常骨髓组其凋亡率低,而其他各个正常骨髓组其凋亡率比单纯对照组有所升高(P<0.05);而各个脓毒症实验组的细胞凋亡率均高于单纯对照组(P<0.05)。2、体内实验:各个实验组细胞的数量均有所改变。在正常骨髓组中,每组的细胞数量均较多,尤其是经过2ng/ml地塞米松处理的正常骨髓组,其细胞数量最多,在显微镜下发现有组织团块;在脓毒症骨髓组,几乎所有实验组在显微镜视野下都找不到细胞结构完好的活细胞,并且能够找到已经凋亡裂解的细胞碎片。而单纯肺组织对照组显微镜下视野观察其细胞形态很差,细胞数量亦很少。通过流式细胞术检测到各个正常骨髓组的凋亡率均比脓毒症组的凋亡率低(P<0.05)。与单纯肺组织对照组相比,正常骨髓细胞组的凋亡率较低,并且在2ng/ml地塞米松处理的正常骨髓组凋亡率最低(P<0.05);而各个脓毒症骨髓组其凋亡率均高于单纯对照组(P<0.05)。3死亡率实验:与单纯对照组相比,各个正常骨髓细胞组其死亡率均低于单纯对照组(P<0.05),而各个脓毒症骨髓细胞组其死亡率与单纯对照组无差异(P>0.05)。正常骨髓细胞组不同浓度的各个实验组之间比较,经过2ng/ml地塞米松处理的正常骨髓细胞组的死亡率最低(P<0.05)。 结论:1、地塞米松可以激发正常骨髓对损伤肺组织的保护作用。2、地塞米松不能动员脓毒症时机体内的骨髓细胞发挥保护作用。3、地塞米松的浓度对动员骨髓细胞的保护作用有一定的影响,2ng/ml的地塞米松对动员骨髓细胞的保护作用最好,较高剂量可能会抑制这种动员作用,从而抑制免疫作用。