Part 1:在水稻抗病虫育种中,抗性基因资源是最重要的,但是在实际的生产应用中,尤其是在现在的杂交育种中,与显性性状基因相比隐性的抗性资源往往难以利用。但是与显性性状相比,隐性基因可能赋予了作物对不同生理小种病原菌或不同生物型害虫新的抗性机制。水稻抗白叶枯病隐性基因Xa13,同时也被证明参与了花药的发育,目前已被克隆并且其抗性机制最近也已被解析。在本研究中我们希望将xa13基因隐性抗病的表型转变为显性表型,希望能借此促进xa13基因在育种中的应用。我们通过使用人工小RNA沉默技术去干涉Xa13基因的表达,并且使用组织特异性的启动子(Osrbcsp和Atrbcsp)避免人工小RNA(ami A和ami B)在花药中的表达,从而保证Xa13基因在花药的发育过程中正常的行使功能。本实验最后得到了符合预期的高抗白叶枯且结实率正常的转基因水稻,证明我们在转基因植株中达到了特异性沉默Xa13基因的效果。本研究为如何在生产育种上利用xa13这种隐性且一因多效的基因提供了一个良好的思路。本实验研究成果如下:1)利用农杆菌介导的遗传转化方法,获得明恢63转基因T0代主要的4个片段分别得到PCR阳性苗为31(Osrbcsp-ami B),27(Atrbscsp-ami A),38(Osrbcsp-ami B)和25(Atbcsp-ami B)。2)接种白叶枯病菌PXO99两周后,野生型明恢63病斑长和病斑面积比例分别为22.75±2.12 cm和88.5±7.0%。与此相比,表达ami B的转基因片段表现出了较强的抗性,Osrbcsp+ami B和Atrbcsp+ami B分别有84.2%(32/38)和80.0%(20/25)的阳性家系表现出了白叶枯抗性,甚至分别有50%(19)和32%(8)达到了高抗水平,即病斑长度小于3 cm;但是转ami A片段抗性效果要远远弱于转ami B的片段。3)通过PAGE Northern实验得知,ami A和ami B都在转基因水稻中表达。我们还进行了Xa13基因的降解是否由于ami RNA介导的5’RACE验证实验,结果显示ami B转基因片段中分离的Xa13 m RNA的5’端序列的12个克隆测序结果完全一致,显示Xa13在与ami B互补序列的第10和11个碱基之间被切断而降解。但ami A-Xa13由于太靠近3’端,而无法设计合适的RACE引物从而无法获得ami A剪切位点的直接结果。4)为了验证Atrbcsp和Osrbcsp的组织特异性,我们通过stem–loop primer特异性反转录了叶片和花药中的ami RNA,RT-PCR结果显示花药中ami RNA的表达量要远远低于叶片。我们进一步进行了q RT-PCR实验,结果显示同一植株背景下,4个片段中的ami RNA在叶片中的表达量为花药中的162倍至1211倍。5)我们选取了两个Osrbcsp+ami B单拷贝家系,在T1代苗期进行了PXO99的接种实验,结果显示隐性抗性性状已经转变为显性性状,T1代符合3:1孟德尔分离比。潮霉素southern和ami B表达检测结果与抗性表型表现出完全的共分离。Part 2:褐飞虱是水稻的主要害虫之一,且不受Bt杀虫蛋白的影响,因此,从水稻种质资源中挖掘抗性基因对于褐飞虱的防治至关重要。RH(Rathu Henatu)是来自于斯里兰卡的籼稻品种,对褐飞虱所有生物型均有良好和持久的抗性。前人的研究在RH中至少定位了4个抗性QTL区间。我们以RH为研究材料,以敏感水稻品种TN1为对照亲本,通过表达谱芯片技术尝试分析RH具有广谱持久抗性的分子生物学基础,并确定了一批候选褐飞虱抗性相关基因。结合芯片分析和前人定位的结果,在抗性QTL区间确定候选的抗性相关基因16个;通过表达模式分析,在4个QTL区段外,利用表达模式筛选出候选褐飞虱抗性相关基因22个。已有研究表明植物激素JA和SA信号途径在植物对害虫的抗性互作中扮演重要角色。我们分析了RH和TN1在褐飞虱胁迫诱导条件下JA和SA相关合成和信号途径基因的表达模式,以及测定了相应RH和TN1体内JA和SA浓度的变化。本研究主要结果如下:1)内参基因是准确检测基因表达量的一个重要决定因素,选择褐飞虱取食条件下稳定的内参对于准确检测褐飞虱取食特异性诱导基因具有重要意义。我们提取了q RT-PCR检测中常用的8个内参基因在不同样品中的原始信号值,比较得知TBP和ubiquitin比较适合用于褐飞虱胁迫条件下的基因表达检测。本研究所有的q RT试验均选择ubiquitin作为内参基因。另外结合明恢63和珍汕97芯片结果我们也发掘了两个表达稳定的新内参基因Os.1321.1.S1_a和Os.145.1.S1_a_at。2)我们使用了Affymetrix的水稻芯片,共检测了57194个探针的表达量。芯片检测结果表明,在针刺处理下,RH出现表达差异的探针数量明显少于TN1。在6 h,RH中针刺差异探针为92,而TN1中为211,表明TN1比RH对于单纯物理伤害反应更剧烈。针刺处理24 h后,RH表达差异的探针为27,TN1中为38,无论是RH还是TN1的基因表达波动明显恢复。3)与针刺模拟的结果相反,接虫6 h,RH中的差异探针数量(209)多于TN1(173),且RH探针表达变化幅度较大(FC>5)的探针数量为35,也明显多于TN1中的12个。该结果表明,RH在褐飞虱为害初期被诱导表达的基因数量更多,对褐飞虱的反应比TN1更迅速。接虫24 h,RH中差异探针数上升到614,其中FC>5的差异探针数由35上升至73;而TN1差异探针数上升到3356,其中FC>5的差异探针数由12上升至349。4)分别对6 h和24 h时间点的RH和TN1的针刺和接虫处理的差异基因进行韦恩图分析,最终得到在RH特特异性表达,且褐飞虱特异性诱导的差异探针共192个,其中6 h 74个,24 h 152个。我们可以预期的是这192个RH中褐飞虱特异性诱导的基因中可能存在潜在的抗性相关基因。5)为了解释RH和TN1在接虫条件下的差异基因在水稻抗虫反应中的功能,我们选取了T6N/T6C,T6P/T6C,T24P/T24C,R6N/R6C,R6P/R6C和R24P/24C六个组别的差异基因用GOEAST进行GO分析。GO分析结果分为BP(biology process)、CC(cellular component)和MF(molecular function),在BP项目中无论是RH还是TN1中P值有显著性差异的一级项目是response to stimulus和metabolic process,有显著差异的是localization项目;在MF项目中,一级项目有极显著差异的是catalytic activity,有显著差异的是binding和enzyme regulator activity;而CC项目中则无明显特点。6)芯片结果显示茉莉酸(JA)途径出现了17个差异基因表达模式,且都为上调,在RH和TN1中信号传导途径的差异基因都为JAZ类型的转录因子,他们是一类JA途径的负调控因子,说明褐飞虱为害可能抑制水稻的JA信号途径;水杨酸(SA)途径的差异基因全部出现在合成代谢途径中,除了与乙烯(ET)途径共有的一个基因出现下调外,其余5个差异基因全部上调;而乙烯合成途径的基因则表现出了下调的。7)我们测定了褐飞虱取食不同时间点(6 h,24 h以及48 h),RH和TN1体内的SA和JA(游离态)的变化情况。结果表明,褐飞虱取食6 h后,RH中SA表现出了明显的上调,但TN1中SA激素水平的变化反应相对滞后,24h后才出现一定的上调,该结果表明在褐飞虱取食诱导下RH中SA水平的变化比TN1更快,幅度也更大。相反的,JA含量在两个品种中,自24 h开始出现明显下调。