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本研究对广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立进行了初步探讨。本论文主要包括两大部分,第一部分是文献综述,第二部分是试验研究。试验研究包括:(一)广西巴马小型猪体细胞培养体系的建立;(二)猪卵母细胞孤雌激活体系的建立;(三)广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立。试验研究的方法和结果归纳如下:
1.本试验旨在建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,为体细胞克隆和转基因等相关操作开辟新的供体细胞来源。利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力;通过免疫荧光对其进行鉴定;通过脂质体介导对分离到的附睾成纤维细胞进行EGFP-N1基因转染。结果成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,可以大量传代和冷冻,目前已经传至60代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,表明瞬时转染附睾成纤维细胞可以获得成功。结论:本实验室可以成功分离广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代。既经济实用又简单稳定。
2.本试验旨在建立新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为体细胞核移植供体和转基因相关操作供体的可能性,为其提供丰富的供体细胞材料。方法:利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力;通过免疫荧光对其进行鉴定;通过脂质体介导对分离到的广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离得到广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传代至60代以上。结论:本实验室可以成功分离广西巴马小型猪肾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的广西巴马小型猪肾成纤维细胞。
3.本试验旨在建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞、脾成纤维细胞以及颗粒细胞体外培养体系,并探讨其作为体细胞核移植供体和转基因相关操作供体的可能性,为其提供大量丰富的供体细胞来源。使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离以上几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外的生长能力和增殖寿命;通过免疫荧光对分离到的新生广西巴马小型猪腹部成纤维细胞进行免疫荧光鉴定。结果成功分离得到了以上几种成纤维细胞,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性。结论:本实验室可以成功分离广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞、脾成纤维细胞以及颗粒细胞,在体外可以培养和传代,可以为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料。
4.本试验旨在建立猪卵母细胞孤雌激活体系,为体细胞核移植和转基因核移植等提供条件。结果表明:卵母细胞用Ion处理1min,其分裂率显著高于处理4min组(91.05%vs.77.56%,P>0.05),囊胚率也高于4min组,但差异不显著(P>o.05)。KEFACE-900融合仪下,当脉冲时程和脉冲次数固定时,卵母细胞的囊胚发育率会随着场强的升高而增加,达到一定限度后又降低,2.0kv/cm组的囊胚率显著高于2.2kv/cm(32.58%vs.20.91%,P>0.05);当场强和脉冲次数固定时,卵母细胞的囊胚发育率也会随着脉冲时程的升高而降低,但差异不显著(P>0.05)。BTXECM2001融合仪下,当脉冲时程和脉冲次数固定时,卵母细胞的囊胚发育率会随着场强的升高而增加,达到一定限度后又降低,但各组间无差异(P>0.05);当场强和脉冲次数固定时,卵母细胞的囊胚发育率会随着脉冲时程的升高而降低,10μs组显著高于90μs组(33.77%vs.22.31%,P>0.05),卵母细胞的分裂率会随着脉冲时程的升高而降低,10μs组显著高于90μs组(93.51%vs.83.08%,P>0.05)。6-DMAP对卵母细胞继续激活培养时,其胚胎的分裂率显著高于其它任何组(P<0.05),囊胚率显著高于CB+CHX组(P<o.05),但与CB和CHX组差异不显著(P>0.05)。胚胎培养液添加5%FBS组的囊胚率显著高于其它任何组(48.3%vs.35.3%,9.4%,35.8%,P>0.05)。胚胎培养液对照组囊胚率显著高于添加pFF组(33.5%vs.18.1%,9.4%,7.6%,P>0.05)。PZM-3+NCSU-23组孤雌胚胎的分裂率显著高于对照组(98.0%vs.90.5%,P>0.05),囊胚发育率显著高于对照组和PZM-3组(44.4%vs.32.7%,40.5%,P>0.05),PZM-3组的囊胚率也显著高于对照组(P>0.05),但分裂率差异不显著(P>0.05)。结论:本试验建立了高效的猪卵母细胞孤雌激活体系,为后续核移植相关工作的开展奠定了基础和条件。
5.本试验旨在建立广西巴马小型猪体细胞核移植体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供优化条件。探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-DMAP和CB对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率。结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75%;附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89%and6.74%vs.82.95%and5.68%,P>0.05);广西巴马小型猪腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40%,67.53%和6.49%。
结论:在本试验条件下,可以采用盲吸法对猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚。