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在乳酸乳球菌的表达研究中,我们发现在培养基上清中始终有一条稳定且表达量较大的蛋白条带。为了探究这些蛋白的本质,挖掘主要蛋白质的潜在功能,本研究利用蛋白质组学技术对该蛋白条带进行了鉴定,并根据结果对打分值最高的蛋白进行了基因克隆、序列分析以及结构预测。同时,通过对该基因编码蛋白的开放阅读框(ORF)及其上下游表达元件进行预测和解析,利用其潜在的启动子、信号肽及终止子等序列,通过引入报告基因,进行了新型乳酸菌分泌型表达载体的设计和构建。培养乳酸乳球菌Lactococcus lactisl.2472,收集上清进行SDS-PAGE,将其中表达量最大的蛋白条带进行切胶回收,胰酶消化后,LC-MS质谱鉴定。对结果进行分析后,以打分值最高的乳球菌未知蛋白为研究对象,根据其ORF前后序列设计引物,提取Lactococcus lactis1.2472基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增该未知蛋白基因usp45(后简称usp),PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5a感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行Sac Ⅰ和Sph Ⅰ酶切及PCR初步鉴定后,对usp基因进行序列测定。测序结果表明,usp基因序列全长2004bp,编码738个氨基酸的,理论分子质量51kDa；4种核苷酸中,GC含量为38.73%、AT含量为61.27%；含有启动子、SD序列、信号肽以及终止信号;序列测定结果与GenBank中已登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列同源性与Lactococcus lactis subsp.菌株(登录号：CV56CP002365.1)相比最为接近,分别为99.9%和99.7%,仅有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致氨基酸序列的改变。蛋白结构预测提示,。为研究usp蛋白对乳酸乳球菌生长的影响,以usp基因上、下游序列为重组臂,以红霉素抗性基因(Emr)为报告基因,进行同源整合载体构建,以敲除usp基因。同时在重组臂设计时,充分考虑usp ORF的启动子、信号肽和终止子序列,为外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入提供前提。PCR扩增Emr基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;PCR扩增usp ORF两端的同源重组左臂LB和右臂RB基因序列,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明：成功获得同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。usp基因敲除后,通过乳酸菌生长曲线测定、相差显微镜和扫描电镜观察,野生型和敲除型略有不同,但总体不影响细菌的生长。本研究具有重要的意义,usp45基因的成功克隆、敲除实验以及外源基因表达的初步研究,为进一步探究usp的功能及构建新型乳酸菌分泌型表达载体奠定了基础。