褐飞虱是我国和亚洲稻区的主要害虫之一。目前主要通过喷洒农药进行防控,但使用过量的农药会造成环境污染,同时也会使褐飞虱产生抗药性。在生产实践中选育抗性水稻品种,利用其安全、经济、有效的优点,已成为褐飞虱防治的首选办法。本研究拟利用RNAi提高水稻抗虫性并尝试解决转基因稻米食用安全风险。众所周知,褐飞虱中肠是褐飞虱与水稻互作的重要界面,肠道是昆虫消化食物和吸收营养的重要器官,食物经口进入消化道后首先接触到的是肠道的上皮细胞,因此利用RNAi技术干扰肠道上皮细胞的重要功能基因,可以抑制其对食物的正常消化和对营养的正常吸收,进而干扰其正常的生理代谢和生长发育,达到防控褐飞虱的目的。因此,在害虫治理的研究中,RNAi分子作用的靶细胞应优先选择害虫的肠道上皮细胞。本课题开展的研究工作如下:①克隆了水稻胚乳特异性启动子Glub-4和韧皮部特异性启动子RSsl;构建含针对生物Ⅰ型褐飞虱NQO基因的RNAi表达框、和删除酶基因及其识别位点的Ti质粒载体,转化水稻明恢63(MH63)。鉴定转基因水稻,通过Northern blot印迹杂交检测阳性植株中RNAi分子的表达水平,结果显示,阳性植株中RNAi分子表达水平较高;进一步检测RNAi分子在高表达的植株的各组织中表达水平,通过组织原位杂交表明RNAi分子在韧皮部的特异性表达,结果显示,其中正义NQO-RNAi RNA在转基因水稻的茎段中无明显杂交信号,而反义NQO-RNAi RNA在转基因水稻的茎段中有明显的杂交信号,主要分布于韧皮部薄壁组织中,在维管薄壁组织也有部分杂交信号,推测可能是表达的小分子RNA扩散其中,或者所用启动子在维管薄壁组织细胞中也有一定的活性。②进行褐飞虱饲喂实验,采用Northern印迹杂交检测取食24小时的褐飞虱体内NQO基因表达水平的变化,以确定RNAi分子对目标基因的抑制效果,结果显示RNAi分子对目标基因的抑制效果明显;进一步通过Northern印迹杂交检测取食6、12、24、48、72小时的褐飞虱体内NQO基因表达水平的变化,以确定RNAi分子对目标基因的抑制效率,结果表明,随着时间的推移,取食转基因水稻的褐飞虱体内NQO的转录本水平在持续下降。③测定了取食转基因水稻24小时后褐飞虱的生长发育受抑制的程度,包括检测若虫的相对生长率(RGR,relative growth rate)、若虫的蜜露量和成虫的死亡率。结果显示,取食对照水稻的5龄若虫相对生长率为0.40 mg.mg-1d-1,取食转基因MH63的成虫相对生长率则为负增长;分泌的蜜露量由对照若虫的21.00 mg.d-1降至处理若虫的8.50 mg.d-1;而死亡率则由对照成虫的47.00%大幅上升至处理成虫的80.20%。其次测定转基因水稻对褐飞虱的耐虫指数和抗生指数的影响。结果表明,在3-4龄褐飞虱若虫取食后,对照MH63苗期的耐虫性指数和抗虫性指数分别为0.746和0.0384;转基因MH63苗期的相应指数分别为0.4518和0.6833。在使用3-4龄若虫取食成株的实验中,对照MH63成株的耐虫性指数和抗虫性指数分别为0.881和0.0225;转基因MH63成株的相应指数分别为0.7349和0.8052。这表明表达NQO-RNAi分子的水稻对褐飞虱具有较强的持续的抗性。④测定转基因水稻的稻米淀粉含量。结果显示,转基因水稻稻米淀粉含量平均为15.4%。进一步检测表明,由于删除酶的作用,稻米胚乳细胞中已不存在外源基因,转基因稻米无食用安全风险。本论文重点研究了 RNAi分子在转基因水稻中的表达谱,对褐飞虱生长发育的影响、评价了转基因水稻的抗虫效果、及外源基因在稻米胚乳中的删除效果。为提高水稻抗虫性的分子育种和解决转基因水稻的食品安全性探索一条新途径。在完成本课题的研究任务之后,后续工作将考虑通过回交转育、杂交等方法结合分子标记辅助选择技术,结合多个抗褐飞虱的基因进行材料的筛选,在水稻的苗期和成株期来选育高抗且持久抗褐飞虱的新品系,尝试育成生产上可以应用的水稻新品种。