论文部分内容阅读
小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)是一种专性活体营养寄生菌,是禾本科布氏白粉菌小麦专化型。白粉菌在与寄主小麦亲和互作过程中,病原菌一旦侵入到寄主表皮细胞内,就会形成一种高度专化的吸器变态结构。白粉菌吸器不仅是从寄主吸取营养物质和能量交换的场所,而且它能在不同程度上参与病原菌生物合成,诱导效应基因在白粉菌吸器内表达,识别寄主植物抗病基因、抑制植物的防卫反应。本研究以感病小麦品种L958为试验材料,建立了分离提取小麦白粉菌吸器的方法,成功分离出形态完整和RNA浓度较高的小麦白粉菌吸器。此外,基于小麦白粉菌的转录组测序结果,通过生物信息学方法得到候选效应基因,并利用酵母分泌系统对筛选到的效应基因进行分泌功能研究。通过研究,得出以下结果:1、利用层析柱法和梯度离心法从接种白粉菌的小麦叶片中分离提取到了浓度较高且形态比较完整的白粉菌吸器,通过对比分离提取到的吸器数量和检测吸器的总RNA浓度,得出:梯度离心法在20g新鲜小麦叶片中分离得到吸器数量约有1.89×10~5个,吸器总RNA浓度为324ng/μL;通过层析柱法在20g新鲜小麦叶片中分离得到吸器数量约有2.19×10~5个,吸器总RNA浓度为725.8ng/μL。证明层析柱法和梯度离心法是两种适合于小麦白粉菌吸器分离提取的方法,且层析柱法更优于梯度离心法。2、在小麦白粉菌基因组研究基础上,利用软件SignalP和TMHMM对11个小麦白粉菌候选基因进行信号肽预测和效应子跨膜区域分析,得到这11个候选基因均为分泌效应基因,这些候选效应基因的蛋白序列中都可能含有一个信号肽序列,信号肽的可能性均在90%-100%之间,且这个信号肽促使它们靶向内膜系统,输出到胞外空间。3、通过分别提取分生孢子、菌丝、吸器的总RNA,采用RT-PCR和qRT-PCR从转录组测序筛选出的11个小麦白粉菌候选效应基因中再次筛选出了5个在小麦白粉菌吸器中高表达的效应基因,分别是TID_seq6013、TID_seq1173、TID_seq4971、TID_seq2965、TID_seq4396。4、通过酵母分泌系统对5个在白粉菌吸器中高表达的候选效应基因进行分泌功能验证。在这5个小麦白粉菌效应子的预测信号肽序列中插入酵母pSUC2空载体可以使酵母菌株YTK12在CMD-W培养基和YPRAA培养基上良好生长,表明这5个效应基因编码的效应子都是典型的分泌蛋白。