组织工程的研究主要在于促进组织的愈合和再生,以弥补其自我愈合能力的不足。组织工程支架作为运载细胞及细胞因子的工具,其物理化学性能以及形貌特征会对细胞的行为产生很大影响。理想的支架应尽可能地模拟将要修复的组织细胞外基质(ECM),从而模拟细胞外生长环境,促进细胞的生长分化。模拟ECM主要通过两个方面来实现,一是形态和结构上的模仿。大多数间充质组织具有含量丰富的胶原蛋白纤维,这些胶原蛋白纤维形成ECM的主要框架结构。因此,纳米纤维结构的材料可能成为理想的组织工程支架材料。不同的组织中的胶原蛋白纤维有其不同的排列,研究发现,纤维支架的排列方式将改变细胞的形态及迁移,从而对细胞的增殖分化产生影响。目前,制备纳米纤维常用的方法有静电纺丝、相分离和自组装等。静电纺丝是利用高压静电对溶液中高分子的吸引,形成很细的液流,当这些液流中的溶剂挥发后即形成纤维。与其它两种方法相比,静电纺丝具有效率高、操作灵活、可用的原料丰富,纤维和支架结构可调等优势,例如,通过改变接收装置即可制备出定向排列的纳米纤维结构。因而,近年来静电纺丝常被用于制备组织工程支架。另一方面则是从成分上模拟。天然高分子以及合成高分子材料均可通过静电纺丝得到纳米纤维。与合成高分子比较,天然高分子具有更好的生物活性。天然高分子又可分为ECM成分以及非ECM成分。明胶作为胶原蛋白的水解产物也是一种ECM成分的天然高分子,研究证实明胶具有良好的生物活性,但其机械性能相对较差。丝素蛋白(SF)是蚕丝及蜘蛛丝的提取物,属于非ECM成分的天然高分子,其生物活性及机械性能都在ECM成分与合成高分子材料之间。明胶和SF都能通过静电纺丝制备出纳米纤维,已经有很多研究将其作为支架材料运用于组织工程,收到了良好的效果。但传统静电纺丝仍存在一些不足,无论是制备成有序还是无序的纤维支架,其纤维都较为致密、孔隙较小,不利于细胞扩散；另外,支架整体为纸片状的2D结构,不利于较大缺损的修复。目前已存在许多增大支架孔径及厚度的方法研究,但对于天然高分子如明胶和SF,在刚形成纤维时稳定性较差,在应用前需通过交联处理来提高其稳定性,而交联常常引起支架的收缩、纤维融合以及孔隙破坏,导致创造出的大孔三维结构因为交联处理而遭到破坏,而达不到理想的效果。另外,许多增大孔径及厚度的方法仅限于无序纤维,而增大有序纤维的孔径及厚度的方法较少且仍存在一些不足。本文采用静电纺丝技术,研究以天然高分子为原料制备大孔三维纳米纤维支架的方法。重点研究了两种不同的天然大分子,明胶及SF,采用具有交联作用的乙醇浴进行静电纺丝纤维收集。通过乙醇对纤维的分散作用以及乙醇本身或其内含交联剂的交联作用“一步交联”明胶及SF纤维,制备出无序与有序两种结构的大孔三维纳米纤维支架,并对其物理、化学及生物性能进行了初步研究。实验一：乙醇浴“一步交联”法制备明胶三维大孔纳米纤维支架的研究目的：探讨采用乙醇浴“一步交联”法制备静电纺丝水溶性天然高分子三维大孔纳米纤维支架。方法：配制15%的明胶醋酸溶液进行静电纺丝,将适量的戊二醛作为交联剂加入乙醇中,配制成具有交联作用的乙醇溶液进行纤维收集,得到乙醇浴“一步交联”纤维支架；另采用纯乙醇进行纤维收集,再将纤维用交联剂溶液处理,得到乙醇浴“二步交联”纤维支架。对两种方法制备的支架的理化性能进行以下检测：用扫描电镜(SEM)观察纤维表征,并利用SEM结果对纤维的直径及孔径进行分析,检测吸水率,通过降解实验以及SEM观察支架在PBS中浸泡14天的形貌变化以检测材料在PBS中的稳定性,采用差示扫描量热法(DSC)检测其热稳定性,用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)实验检测明胶纤维的交联度。结果：在本实验条件下,可制备出纳米纤维。纤维直径分析结果显示：乙醇交联组纤维较交联乙醇溶液中收集的粗(P<0.01),其中交联乙醇未交联组纤维最细,再次经过交联处理后,纤维变粗不显著(P<0.05)。而乙醇未交联组因为干燥方法不同,与其他三组纤维比较纤维最粗(P<0.001)。孔隙分析结果显示：乙醇交联组较交联乙醇中收集的纤维孔隙小(P<0.001)。虽然交联乙醇交联组较交联乙醇未交联组孔径略小,但无统计学差异(P>0.05)。乙醇未交联因干燥方法对孔隙影响较大,与其他组不具可比性。吸水率结果显示：三组交联过的纤维吸水率均较高。其中交联乙醇收集的两组比乙醇交联组的吸水率高(P<0.01)。且交联乙醇中收集的纤维在交联后,具有更高的吸水率(P<0.001)。降解结果显示：7天之内,三组交联过的纤维质量均无明显变化。第14天时,乙醇交联组有两块样品发生明显的降解,但各组之间质量变化仍无统计学差异。通过SEM对第14天的纤维形貌观察可见：乙醇交联组的纤维发生大面积的融合,并且,在交联乙醇未交联组中也可见少量融合现象,但交联乙醇交联组的融合现象不明显。DSC的结果显示：乙醇交联组在66.45℃时明胶发生脱水变性出现一个吸热峰。然而,交联乙醇/／交联组以及交联乙醇未交联组的明胶变性温度分别升高到76.56℃和75.81℃,并且峰稍变低平。乙醇未交联组虽未见典型的吸热峰形成,但在66℃左右可见明显的吸热率增加。交联度检测结果显示：乙醇交联组交联度约33%,低于交联乙醇＼未交联组(约48%,P<0.01)及交联乙醇＼交联组(约56%,P<0.01)。结论：这种乙醇浴“一步交联”技术经济有效,操作简单,无需改变原静电纺丝条件,可通过调整交联时间及交联剂的浓度,达到所需的纤维交联度。将其运用到明胶纳米纤维的制备,可更有效维持纤维的形貌及孔隙结构,提高交联效率,制备出较理想的三维大孔纳米纤维支架。实验二：乙醇浴滚筒法制备丝素蛋白“一步交联”三维大孔有序纳米纤维支架制备条件的研究目的：本研究采用静电纺丝技术,研究乙醇浴滚筒法制备“一步交联”3D大孔有序SF纳米纤维,并与传统方法比较,分析收集方法、SF浓度、滚筒速度以及交联方法对纤维有序性及直径的影响。方法：以乙醇浴配合滚筒作为静电纺丝收集装置,湿法收集静电纺丝有序SF纳米纤维(AW)。在相同条件下利用传统滚筒干法收集有序支架(AD)作为对照,通过SEM观察纤维的表征,并通过SEM图分析其纤维直径分布及排列,探讨和比较两种方法在不同SF浓度以及滚筒转速下收集的纤维的形貌及排列特点。结果：纤维排列分析显示：当SF浓度为8%及10%时,无论AW还是AD,纤维的排列与滚筒的转速有很大的相关性。当湿法滚筒的转速从1.4m/s提高到1.9m/s,或者干法滚筒转速从2.6m/s提高到5.2m/s,纤维有序性将得到提高。但当SF浓度为12%时,滚筒转速的变化对纤维的排列影响不明显,此时在三种速度下收集的纤维都可被认为是有序排列。AW在同等级转速时的有序性通常优于AD。纤维直径分析的结果显示：随着SF浓度从8%上升到10%及12%,平均纤维直径也从0.44μm上升到0.79μm及3.04μm。在SF浓度为8%或10%时,AW的直径与AD的初始直径差异不大(P>0.05),但AD交联后直径变大且大于AW(P<0.05)。当SF浓度为12%时,AW的平均纤维直径为2.84μm,略小于AD的初始平均直径3.01μm(P<0.05),AD交联后直径最大(P<0.001)。在SF浓度为8%时,低中转速制备的纤维直径小于高速下制备纤维；当SF浓度为10%时,低转速下制备的纤维直径大于中高速下收集的纤维。当SF浓度为12%时,低中转速下收集的纤维直径大于高速下收集的纤维。从纤维直径标准差比较的结果看：当SF浓度为8%以及10%时,AW的纤维直径标准差与AD的区别不大,但当SF浓度为12%时,AW的纤维直径标准差小于AD(P<0.05)。另外,在SF浓度为8%时,纤维多较为扁平,且AD上可见较大的斑块,但在AW上几乎看不见斑块。结论：乙醇浴滚筒“一步交联”’法制备有序纤维,得到有序纤维的条件更宽松,有序性也更佳。在乙醇“一步交联”的作用下,纤维初始直径得以维持,纤维及支架结构更均匀。在浓度为10%,选择1.9m/s和5.2m/s分别作为湿法、干法的滚筒转动速度,可在保证纤维的性能的前提下两组都能得到有序的纤维,用于进一步的理化性质及生物性能研究。实验三：乙醇浴滚筒法制备丝素蛋白三维大孔有序纳米纤维支架性能研究目的：在实验二探究的条件下,利用乙醇浴滚筒法制备3D大孔有序SF纳米纤维支架,研究其物理、化学及生物性能,比较其与传统方法制备的支架的差异。方法：制备浓度为10% SF溶液,1)以乙醇浴滚筒作为静电纺丝收集装置,在滚筒速度为1.9m/s的条件下,湿法收集有序纳米纤维(AW)；2)以传统滚筒为收集装置,在转速为5.2m/s的条件下,干法收集有序纳米纤维(AD)；3)直接乙醇浴收集,得到湿法收集的无序纳米纤维(RW)；4)导电平板为收集装置,干法收集无序纳米纤维(RD)。重点对两种方法制备的有序纳米纤维支架进行比较分析,进行了以下实验及检测：通过对同等质量/面积比的支架厚度测量反映其三维及蓬松的特性,检测其孔隙率,通过PBS吸收率反映其吸水性能,通过万能拉力测试机检测支架的拉伸性能,通过收缩率及傅里叶红外光谱(FTIR)分析“一步交联”对纤维结构及分子构象的影响,在支架上进行前成骨细胞MC3T3-E1的培养,通过荧光显微镜及SEM观察细胞的排列及形态,通过MTT实验检测细胞的增殖以及支架的细胞容量,通过组织切片观察细胞的形态及扩散。结果：同等质量/面积比的支架厚度测量结果显示：AD呈纸片样,厚度小于1.0mm,AW则厚达2.5mm左右。孔隙率及PBS吸收率结果显示：AW高于AD的孔隙率(P<0.05)。吸收PBS后的支架平均质量约为原质量的6倍,AW的PBS吸收率高于AD(P<0.05)。支架收缩结果显示：经过氨水/乙醇溶液处理后,两种支架的宽度和长度都有收缩,AD的收缩较AW更明显(P<0.01),冻干后,AD的宽度和长度进一步收缩(P<0.001),然而AW只有长度发生了进一步收缩(P<0.001)。FTIR结果显示：未处理的AW、交联处理后的AW以及交联处理后的AD分别主要在1629,1627和1627cm-1及1521,1523和1523cm-1处有吸收峰,说明其分子构象以稳定的β-折叠结构为主。但未处理的AD则主要在1650和1541cm-1处有吸收峰,说明其主要为不稳定的无规卷曲结构。AW在制备完成时“一步交联”已使其具有足够的稳定性,无需再进行交联处理。荧光显微镜及SEM观察到MC3T3-E1在各组SF纳米纤维支架上都能良好地生长,在有序的纤维上呈长条形,且在AW上的细胞形状更长、排列更有序。MTT实验显示：MC3T3-E1在AW比在AD上增殖更快(P<0.01),且AW能容纳更多的细胞生长(P<0.05)。组织切片结果进一步呈现了细胞在有序排列的纤维支架上呈长条形生长及有序的排列,同时也显示了细胞在能迅速地有序地浸润AW。结论：乙醇浴收集静电纺丝有序纤维使得支架物理性能有显著提高,从而对细胞行为产生较大的影响,在骨组织工程中有较大的应用前景。