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核桃又名胡桃、羌桃，是重要的营养坚果。新疆有着得天独厚的自然资源，适合核桃的生长繁育。尽管对于新疆核桃前人已经进行很多研究的，但是对新疆核桃遗传多样性的研究并不是很深入，尤其是分子标记进行遗传多样性的研究。近年来，核桃资源不断受到各种破坏，随着旅游区的开发，过度放牧以及乱砍乱伐等人为破坏，新疆各个地区核桃的分布面积和居群密度都出现不同程度的萎缩，基因资源没有得到有效地保护。为了对新疆核桃展开种质资源保护以及合理的开发利用打下理论基础，本研究通过对新疆5个不同居群的核桃进行EST-SSR分子标记对其构建聚类图，分析其种质资源遗传多样性，获得结果如下：（1）采用NTSYSpc2.1软件对5个核桃居群进行聚类分析，当GS=0.616，可聚为三个类群，并且新疆核桃种群存在明显的地域性。通过软件POPGENE version32进行分析，五个核桃居群的多态位点的百分比（PPL）介于69.03%至83.23%之间，观测等位基因数（Na）介于1.6903至1.83223；平均观测等位基因数（Na）为1.7626±0.4214；平均有效等位基因数（Ne）为1.3576±0.3473；平均Nei基因多样性（h）为0.2171±0.1812；平均Shannon信息指数（I）为0.3355±0.2523。对核桃居群进行遗传多样性分析发现，居群内的基因多样性（Hs）为0.2171±0.0123，基因流（Nm）为1.2017，表明居群间的基因流顺畅。采用AMOVA软件进行核桃居群的方差分析，结果显示，居群间和居群内差异均极显著，遗传变异主要分布在居群内部；（2）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA条带测序对比发现，两条序列的一致性为67.15％。说明扩增条带有效；（3）EST引物通用性较好，可以应用于核桃属其他植物的EST-SSR研究。