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前言 热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是机体在遭受各种应激刺激后诱导产生的一组应激蛋白，对细胞具有保护作用，这一反应过程称之为热休克反应(heat shock response，HSR)，它是生物细胞在长期进化过程中保留下来的自我保护机制。在机体的大多数器官中均有表达，当生物细胞受到各种理化因素刺激后发生HSR，启动热休克基因表达，使HSP合成增加，起到应激保护作用。HSP70是含量最多的热休克蛋白家族，而且具有多种功能，是一种非特异性细胞保护蛋白，因此备受关注。 庆大霉素(gentamicin，GM)的致命弱点是具有严重的耳毒和肾毒性，常可造成肾功衰竭、听力障碍、平衡失调等。尽管如此，由于其性质稳定、抗菌谱广、抗菌杀菌力强、使用方法简便、价格便宜等优点，至今仍是世界范围内，尤其是发展中国家成为最常使用的抗生素。氨基甙类抗生素(aminoglycosidic antibiotics，AmAn)的耳毒性主要是由于其在内耳的蓄积，导致内耳毛细胞损伤。有文献报道，不同的损伤和细胞耐受损伤程度的不同，HSP70在各细胞间的转录和翻译也不同，但GM中毒后耳蜗HSP70在各细胞间的转录和翻译是否也具有相同现象，尚未见报道。 过去人们一直认为损伤的毛细胞不具有修复能力。近年研究表明，不仅鸟类动物内耳耳蜗和前庭毛细胞破坏后可以再生，同时哺乳动物前庭毛细胞破坏后也保持一定的修复能力。那么，哺乳类动物耳蜗毛细胞破坏后是否具有再生能力呢? 川芎嗪(ligustrazine)是中药川芎的有效成分，属酰氨类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)。本室前期工作表明，TMP通过降低GM中毒耳蜗一氧化氮合酶(NOS)活性，减少NO的过量生成，降低GM的耳毒性。那么TMP对GM耳中毒后不同时间、以及耳蜗毛细胞再生修复过程中起什么作用呢?目前尚未见报道。 本实验应用听脑干反应(anditory brainstem responses，ABR)测试及免疫组化技术、原位杂交技术，观察GM耳中毒后豚鼠耳蜗HS种0及HSP70mRNA的表达，以明确GM中毒后耳蜗HS即0在各细胞间的转录和翻译是否相同。应用ABR测试、免疫组化技术及扫描电镜技术，观察TMP对GM耳中毒后不同时间HS即0的表达及耳蜗毛细胞再生的影响，探讨TMP对GM耳毒性损伤的保护作用及TMP在毛细胞再生修复中的作用机制。实验材料 耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠，体重200一2509，雌雄不拘; GM注射液由沈阳第一制药厂生产; TMP注射液由齐齐哈尔制药厂生产; 25%戊二醛由Sigma公司生产; HSP7O一抗(小鼠抗大鼠IgG)、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、HSP70原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司提供。实验方法‘ 一、实验动物分组及耳毒模型的制备 将豚鼠随机分成GM组、TMP+GM组、TMP组和正常对照组四组。GM组:每日腹腔注射GM注射液10Om岁kg; TMP+GM组每日左侧腹腔注射TMP注射液140m岁kg，同时右侧腹腔注射与GM组等量的GM注射液;TMP组:每日腹腔注射与TMP+GM组等量的TMP注射液;正常对照组:每日腹腔注射与GM等量的生理盐水2.Sln]了kg。各组皆连续用药10天。各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。 二、ABR阑值检测 在用药前和停药后处死前，用1%戊巴比妥钠(40m扩kg)腹腔麻醉。选用主频率为ZkHz的短声刺激信号，耳机距豚鼠外耳道约0.5。m左右。记录电极置颅顶正中，参考电极及接地电极分别置于给声耳及对侧耳后乳突部皮下，以DAT一100型叠加仪进行叠加200次，以vC一ro示波器输出信号，观察时程为20ms，测试强度由95dBnHL开始，听阂判定以玛波为准。 三、耳蜗标本的制备及检测技术 各组豚鼠在行第二次ABR检测后，将豚鼠快速断头，迅速取出听泡。 1 .SABC免疫组化及原位杂交标本:打开听泡后，充分暴露耳蜗，在解剖显微镜下开放卵圆窗和圆窗，在蜗顶缓慢注人含4%多聚甲醛的0.lmoL，L的磷酸缓冲液(PBS)(pH=7 .4)，再将标本置于上述固定液中4℃下固定2小时。PBS冲洗后，放人10%EDTA中4℃下脱钙5一7天，再移人含25%蔗糖的PBS中，4℃过夜。次日用OCT包埋，行巧一20林m恒冷冰冻切片。待切片干燥后，参照即用型SABC免疫组化试剂盒和HSP7O原位杂交检测试剂盒使用说明书要求进行染色。 2.耳蜗毛细胞扫描电镜标本制备:打开听泡后，充分暴露耳蜗，在解剖显微镜下开放卵圆窗和圆窗，在蜗顶缓慢注人0.9%生理盐水，去除耳蜗骨壳和螺旋韧带，暴露Corti’s器，用生理盐水充分洗净标本后，将标本置于含2.5%戊二醛的0.lmoFL的PBS(pH二7.4)固定液中4℃下固定4小时后，再经饿酸后固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，离子溅射真空渡膜，扫描电镜下观察。 四、显微图像分析技术 用数码照相机拍照后，将图像输人计算机，用光笔勾画出耳蜗各待测部位后，应用图像分析软件，在同等条件下测量各部位HS即0阳性反应产物灰度值，分别计算各组各部位平均灰度值。 五、统计分析: 将实验数据进行处理，数据以又士s表示，显著性检验采用t检验及相关分?