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背景和目的慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是一种常见的可预防和可治疗的疾病,其特征在于持续的呼吸道症状和气流受限,通常由于暴露于有毒颗粒或气体所致。肌肉减少症是慢阻肺患者重要的合并症之一,是病死率增加的独立危险因素。合并肌肉减少症的慢阻肺患者运动能力显著下降,而运动耐量不足进一步加重肌肉功能障碍。因此,准确识别慢阻肺患者运动耐量不足及肌肉减少症对改善慢阻肺患者预后至关重要。肌肉减少症主要表现为进行性、广泛性的肌肉功能障碍,在慢阻肺中的发生和发展机制尚未阐明。全身性炎症是慢阻肺患者合并肌肉减少症的主要危险因素。外泌体作为一种细胞间信号传递的重要信使和载体,是局部炎症和全身炎症的重要驱动因子。既往研究显示,血浆外泌体参与慢阻肺患者的全身性炎症。因此,我们推测血浆外泌体在慢阻肺合并肌肉减少症中具有重要作用。外泌体的来源细胞对其所携带的信息具有决定作用。气道上皮细胞是肺部主要的结构细胞。气道上皮损伤是慢阻肺的重要病理特征,受损气道上皮细胞分泌的外泌体在气道重塑和肺部炎症反应中发挥着重要作用。损伤的气道上皮细胞是否通过外泌体途径参与慢阻肺肌肉减少症的发生和发展过程尚不清楚。本课题研究内容分为三个部分:第一部分:股直肌超声评估慢阻肺患者运动耐量不足及肌肉减少症的探索性研究;第二部分:血浆外泌体在慢阻肺患者肌肉减少症发生和发展过程中的作用和机制研究;第三部分:气道上皮细胞来源的Exosomal-miR-142-3p促进慢阻肺肌肉减少症的作用与机制研究。方法第一部分:本部分研究纳入154名稳定期慢阻肺患者,按照7:3的比例随机分为训练集和验证集。应用超声测量患者股直肌厚度（RFthick）和横截面积（RFcsa）,并根据身高进行标准化得到STD-RFthick和STD-RFcsa。通过6分钟步行测试评估慢阻肺患者运动耐量。基于亚洲肌少症工作组于2019年制定的肌肉减少症诊断标准评估慢阻肺患者中的肌肉减少症。应用剪切波超声弹性成像技术测量患者股直肌平均弹性指数（SWEmean）。第二部分:收集慢阻肺患者及烟雾暴露模型小鼠的血浆样本,应用超速离心法提取血浆来源的外泌体;应用EXOCET试剂盒对外泌体进行定量分析,探索血浆外泌体数量与骨骼肌数量及功能的相关性。提取空气暴露组小鼠及烟雾暴露模型组小鼠的血浆外泌体,尾静脉注射入C57BL/6小鼠,探索血浆外泌体对骨骼肌数量及功能的影响。提取健康对照及慢阻肺患者的血浆外泌体,作用于人原代骨骼肌细胞,检测增殖、凋亡、代谢及蛋白降解能力变化。第三部分:香烟烟雾提取物（CSE）刺激气道上皮细胞后,应用超速离心法提取外泌体作用于骨骼肌细胞,检测增殖及蛋白降解变化。应用miRNA-seq筛选CSE处理后的气道上皮细胞外泌体中差异表达的miRNA。PCR检测慢阻肺患者外泌体中miR-142-3p表达水平。在气道上皮细胞或骨骼肌细胞中转染miR-142-3p的模拟物,检测骨骼肌细胞功能变化。腺相关病毒6型和9型分别用于在小鼠体内干预气道上皮细胞和骨骼肌细胞中miR-142-3p的表达水平。RNA-seq用于筛选骨骼肌细胞中miR-142-3p可能调控的通路。结果第一部分:1.RFthick、RFcsa与慢阻肺患者的临床特征（肺功能、临床症状和运动耐量）显著相关;其中与6分钟步行距离（6MWD）相关性最高（RFthick:r=0.870,p＜0.001;RFcsa:r=0.883,p＜0.001）。2.训练集:男性慢阻肺患者中,基于STD-RFthick、STD-RFcsa预测6MWD＜350m的最佳临界值分别为3.098cm/m和4.052 cm2/m;女性慢阻肺患者中,基于STD-RFthick、STD-RFcsa 预测 6MWD＜350m 的最佳临界值分别为 3.319 cm/m 和 4.366 cm2/m;验证集检验了 STD-RFthick和STD-RFcsa的最佳临界值,AUC值分别为0.881 和 0.903。3.合并肌肉减少症的慢阻肺患者的RFthick（4.96±0.39cm vs 5.71 ± 0.60 cm,p＜0.001）和 RFcsa（6.53±0.40 cm2 vs 7.32±0.52 cm2,p＜0.001）显著低于不合并肌肉减少症的慢阻肺患者4.训练集:男性慢阻肺患者中,基于STD-RFthick、STD-RFcsa预测肌肉肌少症的最佳临界值分别为3.234cm/m和4.071 cm2/m;女性慢阻肺患者中,基于STD-RFthick、STD-RFcsa预测肌肉减少症的最佳临界值分别为3.330 cm/m和4.315 cm2/m;验证集检验了 STD-RFthick和STD-RFcsa的最佳临界值,AUC值分别为0.823 和 0.853。5.慢阻肺患者股直肌SWEmean（8.98±3.12Kpa）显著低于健康受试者（17.0±1.34Kpa）;SWEmean与慢阻肺患者的临床特征（肺功能、临床症状、运动耐量和肌肉功能）显著相关;合并肌肉减少症的慢阻肺患者的SWEmean（7.08±1.56Kpa vs 10.24±3.28Kpa,p＜0.001）显著低于不合并肌肉减少症的慢阻肺患者;SWEmean能够有效预测慢阻肺患者的肌肉减少症（AUC:0.863,p＜0.001）。第二部分:1.与健康对照相比,慢阻肺患者血浆外泌体数量显著上调;与不合并肌肉减少症症的慢阻肺患者相比,合并肌肉减少症的慢阻肺患者血浆外泌体数量显著上调。2.慢阻肺患者血浆外泌体数量与骨骼肌质量、肌肉力量（握力和股四头肌力量）、运动耐量（6MWD）和股直肌尺寸（肌肉横截面积和厚度）显著负相关。3.3个月香烟烟雾暴露诱导小鼠肌肉减少表型（肌肉数量及力量的同时降低）;同时,小鼠血浆外泌体数量与小鼠抓力显著负相关。4.烟雾暴露模型组小鼠血浆外泌体显著降低了小鼠骨骼肌数量（肌肉重量和肌纤维横截面积显著下降）和骨骼肌功能（抓力和强迫游泳时间下降）。5.慢阻肺患者血浆外泌体抑制人原代骨骼肌细胞的增殖能力、诱导细胞凋亡、诱导细胞糖酵解、增加蛋白降解速度及增强蛋白酶体活性。第三部分:1.体外实验中:香烟烟雾提取物刺激气道上皮细胞分泌的外泌体抑制骨骼肌细胞增殖、增强泛素-蛋白酶体活性、促进蛋白分解代谢;小鼠实验显示:香烟烟雾提取物刺激小鼠气道上皮细胞分泌的外泌体通过循环途径诱导小鼠肌肉减少的发生。2.miRNA-seq及体外实验显示:香烟烟雾刺激的气道上皮细胞外泌体中miR-142-3p促进骨骼肌细胞蛋白分解代谢,抑制骨骼肌细胞功能。3.合并肌少症的慢阻肺患者血浆外泌体中miR-142-3p表达水平显著高于健康对照及不合并肌肉减少症的慢阻肺患者;此外,慢阻肺患者血浆外泌体中miR-142-3p的表达水平能有效预测肌肉减少症（AUC:0.869,p＜0.001）。4.小鼠体内实验显示:抑制气道上皮细胞或骨骼肌细胞中miR-142-3p的表达均能显著逆转烟雾诱导的小鼠肌肉减少。5.转录组学测序提示miR-142-3p参与调控骨骼肌细胞中的PI3K/AKT通路。结论1.超声测量的股直肌厚度和横截面积能够有效预测慢阻肺患者运动耐量不足及肌肉减少症;股直肌剪切波超声弹性成像是评估慢阻肺患者肌肉功能的潜在临床工具。2.在慢阻肺患者和烟雾暴露模型小鼠中:血浆外泌体与骨骼肌数量及功能显著相关,参与调控肌肉减少症的发生和发展过程。3.香烟烟雾诱导气道上皮细胞分泌富含miR-142-3p的外泌体,通过循环系统传递至骨骼肌细胞,抑制PI3K-AKT通路,激活泛素-蛋白酶体系统,促进骨骼肌细胞蛋白分解代谢,介导慢阻肺肌肉减少症的发生和发展过程。